银杏内生真菌的分离鉴定及其产黄酮的初步研究

论文摘要

内生真菌(Endophytic fungi)是指那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。近年来的研究表明,内生真菌与宿主协同进化,可以产生与宿主相同或相似的代谢产物,对相应的内生真菌及其代谢产物的研究已经成为寻找药物来源的一种新途经。本文以我国特有植物——银杏(Ginkgo biloba L.)为实验材料,采用组织印迹培养法对贵州、四川、山东等地银杏的根、茎、叶不同组织进行内生真菌的分离,确定如何区分组织内生真菌与表面附生菌。实验结果表明,银杏内生真菌分离的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞结合的方法较好。对银杏叶片、叶柄、叶柄基部、幼茎、树皮、须根、根的酒精消毒时间为3 min,升汞消毒时间分别为1 min、2 min、2 min、3 min、4 min、2 min、3 min为最佳。在所试条件下共计分离得到78株内生真菌。本文采用高效液相色谱HPLC法与氯化铝比色法,检测到7株分离自不同地区银杏的根、茎、叶产黄酮类物质真菌。HPLC检测结果显示此7株菌均产生黄酮苷元槲皮素,并对此7株菌槲皮素含量进行定量计算。此7株菌的形态学及分子生物学的鉴定结果表明,它们分属于刺盘孢属(Colletotrichum)和镰孢属(Fusarium)。其中,菌株QC102经鉴定为Colletotrichum acutatum Simmonds.,其总黄酮产量可达8.2μg/mL,其菌丝体和发酵液中的槲皮素产量分别为16.8μg/g和6.3μg/mL。采用形态学和分子生物学结合的方法对所得菌株进行鉴定。对分离纯化的78株真菌,鉴定为10属真菌,分属于3个亚门,5纲,7目,8科。鉴定结果在一定程度上反应了银杏内生真菌的生物多样性。确定银杏内生真菌优势菌群是链格孢属(Alternaria)、镰孢属(Fusarium)、刺盘孢属(Colletotrichum)、拟茎点霉属(Phomopsis)。试验结果表明,银杏不同组织部位内生真菌数量和菌群存在着一定的差异。其中银杏叶中优势菌群为链格孢属(Alternaria)和刺盘孢属(Colletotrichum),茎和根中优势菌群均为镰孢属(Fusarium)。叶中特有菌群为枝顶孢霉属(Acremonium)、叶点霉属(Phyllosticta)和裂褶菌属(Schizophyllum),茎中的特有菌群为木霉属(Trichoderma)和腐皮壳属(Diaporthe),根中的特有菌群为小球腔菌属(Leptosphaeria)。本试验还对不同地区银杏的内生真菌进行了研究,结果表明内生真菌在不同采集地的银杏中内生真菌的优势菌群不同。其中,采集于贵州大学和四川成都的银杏优势菌群为链格孢属(Alternaria);采集于四川青城山和雅安的银杏优势菌群为刺盘孢属(Colletotrichum);采集于四川峨嵋山的银杏优势菌群为枝顶孢霉属(Acremonium);采集于四川绵阳、平武和山东烟台的银杏优势菌群为镰孢属(Fusarium);采集于贵州遵义的银杏优势菌群为拟茎点霉属(Phomopsis)。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 植物内生真菌的研究概况
• 1.1 内生真菌的分布及生物多样性
• 1.2 药用植物内生真菌及活性代谢产物
• 2 银杏及其代谢产物简介
• 2.1 银杏简介
• 2.2 银杏开发利用价值
• 2.3 银杏内生真菌的研究概述
• 3 分子生物学技术在内生真菌研究中的应用
• 3.1 现阶段内生真菌研究的一般方法
• 3.2 分子生物学技术的引入
• 4 本研究的内容
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 银杏内生真菌的分离
• 1 材料与方法
• 1.2 仪器和试剂
• 1.3 分离培养基
• 1.4 内生真菌分离纯化方法
• 1.5 保存方法
• 2 结果与分析
• 2.1 消毒剂及消毒时间的确定
• 2.2 银杏内生真菌的分离结果
• 2.3 银杏生长朝向对于内生真菌数目的影响
• 3 小结与讨论
• 3.1 内生真菌的分离
• 3.2 内生真菌分离方法的有效性
• 第三章 银杏内生真菌的产黄酮类物质的初步研究
• 1 材料和方法
• 1.1 仪器、药材和试剂
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 氯化铝法检测黄酮
• 2.3 标准品及样品的HPLC检测图谱与分析
• 3 小结与讨论
• 第四章 银杏内生真菌的分类鉴定
• 第一节 银杏内生真菌的形态学鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株及培养基
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 内生真菌的形态学鉴定方法
• 1.3.1 观察描述方法
• 1.3.2 培养性状的观察要点
• 1.3.3 微观形态观察要点
• 1.3.4 标本的制作
• 1.3.5 显微摄影照片
• 1.3.6 菌种的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 部分内生真菌形态描述
• 3 一株银杏内生裂褶菌的鉴定
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 小结
• 第二节 银杏内生真菌的分子生物学鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验菌株及培养
• 1.2 仪器和试剂
• 1.3 基因组DNA的提取及纯化
• 1.4 DNA纯度的检测
• 1.5 多聚酶链式反应（PCR扩增）
• 1.6 扩增产物的纯化及序列的测定
• 1.7 内生真菌的分子鉴定及系统发生关系分析
• 2 结果与分析
• 2.1 ITS区段的PCR扩增
• 2.2 PCR扩增产物的序列测定
• 2.3 在GenBank上的搜索（Blast）结果
• 2.4 银杏内生真菌的分子生物学鉴定及系统发生关系分析
• 第三节 小结与讨论
• 1 银杏内生真菌的多样性及分布的讨论
• 2 产黄酮内生真菌的讨论
• 3 银杏内生真菌中的担子菌——对内生真菌概念范畴的讨论
• 4 内生真菌与病原菌的关系——探讨宿主致病原因的讨论
• 5 分子系统学与内生真菌分类的讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 图版