慢性心衰大鼠心肌细胞钙调控异常及药物干预的研究

论文摘要

第一部分慢性心力衰竭与心肌细胞异常的钙循环目的:心肌细胞肌浆网的钙循环异常是心力衰竭发病的主要原因之一,但其确切机理和相关分子机制还不甚清楚,本实验以大鼠慢性心衰模型作为研究对象,在细胞和亚细胞水平对心肌细胞胞浆内钙瞬变、肌浆网内钙容量以及钙调控相关蛋白表达的变化进行了研究,从而更深入地了解心衰的分子机制。方法:（1）实验分组:28只雄性SD大鼠随机分为两组,假手术组（n=10）和心衰组（n=18）;（2）慢性心衰模型的建立:心衰组大鼠行冠状动脉左前降支永久性结扎,假手术组大鼠除未结扎冠脉外,其余手术步骤均同心衰组。4周后分别观察各组动物存活率和心功能各项指标;（3）心肌细胞L-型钙电流、胞浆内钙瞬变和肌浆网内钙容量的测定:采用常规酶解法分离心室肌细胞,Fluo-3/AM负载心肌细胞,运用全细胞膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜联机技术同步记录各组大鼠心肌细胞L-型钙电流和胞浆内钙瞬变（即钙诱导钙瞬变）;利用咖啡因诱导钙瞬变的方法,间接记录肌浆网内钙容量（即咖啡因诱导钙瞬变）的变化;同时利用Fluo-5N/AM负载心肌细胞,直接记录肌浆网内钙容量的变化;（4）钙调控蛋白mRNA转录量的检测:提取各组大鼠心肌组织总RNA,采用Real-time quantitative RT-PCR方法检测钙调控蛋白mRNA的转录量;（5）钙调控蛋白表达的测定:将各组大鼠左室心肌组织的膜蛋白提取后,采用Western-blot法测定钙调控蛋白的表达水平,并进行蛋白表达半定量分析;（6）统计学分析:利用SPSS11.5统计软件进行数据处理,所有数据以均数±标准差（ （X|—）±SD）表示,两组间均数的比较采用t检验,率的比较采用Fisher’s Exact检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果:（1）心功能的比较:心衰组和假手术组存活率分别为83.3%和100%,两者相比差异无显著（P>0.05）;与假手术组（n=10）相比,心衰组（n=15）左室终末舒张压（LVEDP）明显升高（8.3±0.42 mmHg VS 4.7±0.65 mmHg,P<0.01）,心重体重比（HW/BW）明显增加（6.76±0.36 VS 3.33±0.41,P<0.01）,左心室内压最大上升速率(dp/dtmax)明显减小（2,140.41±118.38 mmHg/s VS 4,355.75±259.71 mmHg/s,P<0.01）,左心室内压最大下降速率(dp/dtmin)明显减小（-1,798.33±111.41 mmHg/s VS -2,531.22±414.66 mmHg/s,P<0.01）;（2）心衰组大鼠（n=20）单个心肌细胞的ICa·L比假手术组（n=18）显著降低,且平均电流密度值亦明显减小（1.01±0.09 VS 2.18±0.1,P<0.01）;（3）心衰组大鼠（n=12）CICR过程中的钙瞬变幅度比假手术组（n=10）明显下降,且钙瞬变峰值（ΔF/F0）亦明显下降（12.2±0.56 VS 17.8±0.53,P<0.01）;（4）心衰组大鼠（n=12）咖啡因诱导钙瞬变过程中钙瞬变幅度比假手术组（n=10）明显降低,且钙瞬变峰值（ΔF/F0）亦明显下降（12.4±0.4 VS 33.2±1.9,P<0.01）;（5）心衰组大鼠单个心肌细胞（n=12）Fluo-5N/AM染色后荧光强度比假手术组（n=10）显著降低,且荧光强度变化的平均值（ΔF/F0）亦明显下降（26.6±1.87 VS 49.6±2.02,P<0.01）;（6）与假手术组相比,心衰组大鼠心肌细胞RyR2的mRNA表达RyR2/GAPDH（0.063±0.002 VS 0.064±0.003 ,n=8 , P>0.05 ）;PLB的mRNA表达PLB/GAPDH （0.063±0.003 VS 0.058±0.002,n=8,P>0.05）均无显著差异;FKBP12.6、SERCA2a、NCX、Cav1.2的mRNA表达FKBP12.6/GAPDH （ 0.018±0.002 VS 0.042±0.002 , n=8 , P<0.01 ）、SERCA2a/GAPDH（0.14±0.019 VS 0.28±0.016,n=8,P<0.01）、NCX/GAPDH（0.07±0.016 VS 0.12±0.019,n=8,P<0.01）及Cav1.2/GAPDH（0.01±0.0012 VS 0.026±0.0019,n=8,P<0.01）均明显降低;（7）与假手术组相比,心衰组大鼠心肌细胞RyR2/GAPDH（0.36±0.028 VS 0.39±0.03,n=8,P>0.05）,PLB/GAPDH（0.5±0.02 VS 0.57±0.03,n=8,P>0.05）的表达均无显著差异,FKBP12.6/GAPDH（0.13±0.007 VS 0.9±0.05,n=8,P<0.01）、SERCA2a/GAPDH（0.74±0.02 VS 1.36±0.009,n=8,P<0.01）、NCX/GAPDH（0.18±0.03 VS 0.78±0.05,n=8,P<0.01）及DHPR/GAPDH（0.11±0.01 VS 1.2±0.05,n=8,P<0.01）的表达均明显降低。结论:慢性心衰大鼠心肌细胞内钙循环异常主要是由与钙释放和钙回摄相关的钙调控蛋白表达的异常所引起。具体如下:（1）慢性心衰大鼠心肌细胞L-型钙通道（DHPR）表达下调,造成钙诱导钙释放（CICR）过程出现异常,最终导致心肌兴奋-收缩耦联（ECC）障碍,心肌收缩力下降。（2）慢性心衰大鼠心肌细胞内FKBP12.6表达下调,使其对RyR2的稳定作用减弱,导致RyR2在心肌细胞舒张期泄漏过多的Ca2+,使肌浆网内钙容量降低,从而引起ECC过程中所需要的钙释放量减少,最终导致心肌收缩力降低。（3）慢性心衰大鼠心肌细胞内钙泵（SERCA2a）表达下调,致ECC结束后钙回摄功能障碍,导致肌浆网内钙容量减少,最终造成心肌收缩力下降。第二部分氧化苦参碱对慢性心衰大鼠心肌保护作用机制的研究目的:氧化苦参碱（Oxymatrine, OMT）是从豆科槐属植物苦豆子提取的氧化生物碱,属于四环的喹嗪啶类,具有抗炎、抗过敏、保肝、抗病毒及抗寄生虫等多方面药理作用,是临床上常用的治疗肝炎的药物。本实验以慢性心衰大鼠作为模型,在先前研究的基础上探讨氧化苦参碱对心肌细胞内钙离子,钙通道及钙调节相关蛋白的影响,以期获得其心脏保护作用的机制,并为此药在临床上的开发及应用提供基础理论支持。方法:（1）实验分组:60只雄性SD大鼠随机分为五组,假手术组（n=12）、心衰组（n=12）、低剂量OMT干预组（n=12）（25mg/kg, qd）、中剂量OMT干预组（n=12）（50mg/kg, qd）和高剂量OMT干预组（n=12）（100mg/kg, qd）;（2）心衰模型的建立:心衰组和药物干预组大鼠行冠状动脉左前降支永久性结扎,假手术组大鼠除未结扎冠脉外,其余手术步骤均同心衰组。4周后分别检测各组动物存活率和心功能各项指标;（3）心肌细胞L-型钙电流、胞浆内钙瞬变和肌浆网内钙容量的测定:采用常规酶解法分离心室肌细胞,Fluo-3/AM负载心肌细胞,运用全细胞膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜联机技术同步记录各组大鼠心肌细胞L-型钙电流和胞浆内钙瞬变;利用咖啡因诱导钙瞬变的方法,间接记录肌浆网内钙容量;（4）透射电子显微镜形态学观察:各组大鼠心室肌组织被切成1mm3的小块后,经固定、脱水、包埋、修块、切片、染色等处理后于电镜下观察并拍照;（5）钙调控蛋白mRNA转录量的检测:提取各组大鼠心肌组织总RNA,采用Real-time quantitative RT-PCR方法检测钙调控蛋白mRNA的转录量;（6）钙调控蛋白表达的测定:将各组大鼠左室心肌组织的膜蛋白提取后,采用Western-blot法测定钙调控蛋白的表达水平,并进行蛋白表达半定量分析;（7）统计学分析:采用SPSS11.5统计软件进行数据处理,所有数据以均数±标准差（ （X|—）±SD）表示,各组间均数的比较采用单因素方差分析（ANOVA）,组间两两比较时用LSD法。P<0.05认为差异有统计学意义。结果:（1）各组大鼠心功能的比较:各组大鼠存活率均为100%。与假手术组相比,心衰组左室终末舒张压（LVEDP）明显上升（8.1±0.24 VS 3.7±0.49,n=12, P<0.01）,心重体重比（HW/BW）明显增加（4.39±0.36 VS 2.41±0.06,n=12, P<0.01）,左心室内压最大上升速率(dp/dtmax)（2,458.85±124.05 mmHg/s VS 4,164.63±130.69 mmHg/s,n=12, P<0.01）、左心室内压最大下降速率(dp/dtmin)（-1,594.85±214.22 mmHg/s VS -2,765.82±152.99 mmHg/s,n=12, P<0.01）均明显减小;与心衰组相比,中剂量和高剂量药物干预组大鼠的左室终末舒张压（LVEDP）明显下降（5.1±0.24 mmHg,4.6±0.34 mmHg VS 8.1±0.24 mmHg,n=12, P<0.01）,心重体重比（HW/BW）明显降低（3.11±0.08,3.09±0.08 VS 4.39±0.36,n=12, P<0.05）,左心室内压最大上升速率(dp/dtmax)（3,827.77±212.73 mmHg/s,3,910.72±101.36 mmHg/s VS 2,458.85±124.05 mmHg/s,n=12, P<0.01）、左心室内压最大下降速率(dp/dtmin)（-2,537.75±213.09 mmHg/s,-2,548.28±205.65 mmHg/s VS -1,594.85±214.22 mmHg/s,n=12, P<0.01）均明显升高;（2）与假手术组相比,心衰组大鼠单个心肌细胞的ICa·L显著降低,且平均电流密度值亦明显减小（1.89±0.19 VS 6.48±0.33,n=20,P<0.01）;与心衰组比较,中剂量和高剂量药物干预组大鼠单个心肌细胞的ICa·L明显加强,且平均电流密度值亦明显增强（4.35±0.32,4.21±0.24 VS 1.89±0.19,n=20,P<0.01）;（3）与假手术组相比,心衰组大鼠CICR过程中的钙瞬变幅度明显下降,且钙瞬变峰值（ΔF/F0）亦明显下降（12.52±1.38 VS 41.37±2.44,n=12,P<0.01）;与心衰组相比,中剂量和高剂量药物干预组大鼠CICR过程中的钙瞬变幅度明显升高,且钙瞬变峰值（ΔF/F0）亦明显上升（26.82±1.02,30.07±0.91 VS 12.52±1.38,n=12,P<0.01）;（4）各组大鼠心肌细胞SR钙容量的比较:与假手术组相比,心衰组大鼠咖啡因诱导钙瞬变过程中钙瞬变幅度明显降低,且钙瞬变峰值（ΔF/F0）亦明显下降（17.05±0.61 VS 35.36±0.89,n=12,P<0.01）;与心衰组比较,中剂量和高剂量药物干预组大鼠咖啡因诱导钙瞬变过程中钙瞬变幅度明显升高,且钙瞬变峰值（ΔF/F0）亦明显上升（32.3±0.74,32.19±0.51 VS 17.05±0.61,n=12,P<0.01）;（5）各组大鼠心室肌细胞超微结构显示:假手术组大鼠心肌细胞的肌小节完整,肌丝排列整齐,线粒体结构正常,嵴排列紧密,糖原颗粒丰富。心衰组大鼠部分心肌细胞肌丝溶解,并出现大小不等的空泡,线粒体肿胀,嵴断裂。低剂量药物干预组大鼠心肌细胞肌丝溶解有轻微恢复,但线粒体仍肿胀,嵴断裂。中剂量药物干预组大鼠心肌细胞肌丝溶解现象消失,肌丝排列整齐,紧密,清晰,线粒体结构基本完整,嵴排列紧密。高剂量药物干预组大鼠心肌细胞表现基本同中剂量组,且线粒体的电子密度增加;（6）与心衰组比较,中剂量和高剂量药物干预组大鼠心肌细胞SERCA2a、Cav1.2的mRNA表达SERCA2a/GAPDH（0.2±0.017,0.2±0.019 VS 0.12±0.014,n=8,P<0.01）、Cav1.2/GAPDH（0.02±0.002,0.02±0.002 VS 0.014±0.002,n=8,P<0.01）均明显升高;（7）与心衰组比较,中剂量和高剂量药物干预组大鼠心肌细胞SERCA2a/GAPDH（0.94±0.053,1.36±0.059 VS 0.25±0.032,n=8,P<0.01）、DHPR/GAPDH（0.3±0.027,0.28±0.019 VS 0.18±0.015,n=8,P<0.01）的表达均明显升高。结论:氧化苦参碱（OMT）对慢性心衰大鼠的心肌细胞具有保护作用,而这种保护作用表现在大鼠心功能的改善。具体如下:（1）在氧化苦参碱（OMT）的干预下,慢性心衰大鼠心肌细胞L-型钙通道（DHPR）表达上调,促使L-型钙电流的增大和钙诱导钙释放（CICR）的恢复,最终使心肌收缩力增强,心功能得以改善。（2）在氧化苦参碱（OMT）的干预下,慢性心衰大鼠心肌细胞内钙泵（SERCA2a）表达上调,促使心肌兴奋-收缩耦联（ECC）结束后钙回摄功能恢复,肌浆网内钙容量增加,最终促使心肌收缩力加强,心功能改善。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词对照表
• 前言
• 第一部分 慢性心力衰竭与心肌细胞异常的钙循环
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 氧化苦参碱对慢性心衰大鼠心肌保护作用机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 在读期间发表论文和参加的科研工作情况说明
• 致谢
• 综述
• 参考文献