论文摘要
【目的】诱骗受体3（decoy receptor 3,DcR3）,一种新的肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor,TNFR）,具有调节细胞生长发育和分化以及抗凋亡的生物学特性。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是双链RNA（dsRNA）介导的序列特异性转录后同源靶基因沉默效应。由于小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）在哺乳动物细胞中可以诱导RNAi效应,它已经成为基因功能研究的重要工具。本研究利用RNAi干扰技术探讨siRNA对结肠癌细胞株SW480 DcR3基因表达的影响,探索siRNA作为基因治疗新策略的可行性。【方法】1.选择较为方便的化学合成法,针对靶标DcR3基因,利用Dharmacon公司的免费设计软件设计了合成了4组siRNA序列,通过脂质体转染试剂将其转入结肠癌细胞株SW480,同时设立control siRNA组和空白对照组。转染24h后在细胞培养状态下,用倒置显微镜观察细胞生长状态及细胞形态学改变。2.四甲基偶氮唑盐（MTT）试验检测转染后SW480细胞活性,分别计算转染后12h、24h和48h细胞存活率,观察DcR3 siRNA对细胞生长增殖的影响。3.免疫组化技术观察siRNA对SW480细胞内DcR3蛋白的影响;蛋白表达分析:目标靶基因和无关对照的蛋白表达水平通过Western Blot方法检测。4. RNA纯化和分析:常规试剂盒抽提总RNA,以分光光度计定量。目标靶mRNA的表达水平通过荧光定量RT-PCR（ABI7000）检测。【结果】1. DcR3 siRNA作用24h后,形态学可见SW480细胞生长受抑,形态发生明显变化,细胞体积大部分减小.边界清楚,其胞浆内可以看到许多颗粒,细胞碎片增多,且细胞数目减少,生长较分散。空白对照组和control siRNA组细胞细胞形态多样,细胞体积大.边缘不清;细胞胞浆较丰富,饱满而透亮;细胞生长紧密.甚至呈叠堆生长。2.以4组siRNA转染SW480细胞, MTT试验结果显示各组siRNA对细胞增殖均有明显的抑制效应,但此抑制效应作用随时间延长而逐渐减低。3.免疫组化与Western blot结果显示:与对照组相比,转染DcR3 siRNA后,细胞DcR3蛋白表达水平明显下降,转染24h后DcR3蛋白含量下降约60%-15% ,单因素方差分析显示与对照组相比,差异有统计学意义（p<0.05）。control siRNA组与空白对照组比较无差异（p>0.05）。4.实时荧光定量RT-PCR检测结果显示,DcR3 siRNA转染24 h,细胞内DcR3 mRNA的表达与空白对照组相比最低降低了4.12倍,而对照组GAPDH mRNA的表达无明显抑制。【结论】1. DcR3 siRNA对SW480细胞的生长和增殖有明显的抑制作用,使凋亡细胞增加.2. DcR3 siRNA能降低SW480细胞内DcR3蛋白的表达,3.DcR3 siRNA:对SW480细胞的抑制增殖及诱导凋亡作用可能是通过降解内源性的DcR3 mRNA,使DcR3蛋白表达下降而实现的。体内研究证实,DcR3 siRNA可抑制结肠癌SW480细胞增殖,诱导凋亡。DcR3 siRNA通过特异、高效地沉默结肠癌细胞DcR3 mRNA的表达,发挥抑制结肠癌细胞生长的作用。因此,RNAi技术可为结肠癌提供一种新的特异性基因治疗方法。