阿卡波糖生产菌株选育及其发酵条件优化的研究

论文摘要

阿卡波糖首次从游动放线菌发酵液中分离到,是一种糖苷酶抑制剂,对肠道内的蔗糖酶、麦芽糖酶、糊精酶和葡萄糖淀粉酶都有强烈的抑制作用。还具有良好的药动学性质和低毒性,可以降低人体肠道内多糖及寡糖的分解,进而降低血糖浓度,在临床上作为治疗II型糖尿病的药物具有巨大的应用前景。我们实验室分离的一菌株ZJB-08196,其发酵液中发现有阿卡波糖产生。结合形态学特征和分子生物学鉴定,确定菌株ZJB-08196属于Actinoplanesutahensis,通过多轮育种,获得阿卡波糖高产菌株。论文建立了精确、稳定检测A.utahensis ZJB-08196发酵液中阿卡波糖的HPLC分析方法。采用单因素实验,优化了A.utahens s ZJB-08196的发酵条件,获得最佳培养基配方（g/l）:麦芽糖50.0,葡萄糖30.0,黄豆饼粉16.0,谷氨酸单钠5.0,CaCO32.5,CaCl22.0,FeCl30.5,K2HPO42.0,甘油5.0;最佳发酵条件:摇瓶选用不带挡板的三角瓶,发酵初始pH值为7.0,装液量50 ml/500 ml,转速200 rpm,接种量9%,发酵温度27℃,培养156h。在最佳培养条件下,阿卡波糖发酵产量可达4210 mg/l。前体物质井冈霉素A的添加对阿卡波糖合成有促进作用,添加0.24 g/l井冈霉素A最有利于阿卡波糖合成,相比未添加的阿卡波糖可提高47.5%。实验发现,甘油在培养基中作为调节渗透压物质,可以有效地提高阿卡波糖产量。基于上述基础,考察了初始渗透压的影响,发现渗透压为591 mOsm/kg左右,A.utahensis ZJB-08196合成阿卡波糖能力最大。进一步对A.utahensis ZJB-08196补料发酵工艺优化,最佳补料工艺:基础液30 ml,从48 h开始补料,分四次,每次5 ml,每隔24 h补一次;最佳补料组分:麦芽糖14.0g/l,葡萄糖6.0g/l,黄豆饼粉9.0g/l。在最佳的补料工艺和料液组分条件下发酵,阿卡波糖产量可达4877.75 mg/l。基于摇瓶分批发酵实验结果,建立了A.utahensis ZJB-08196发酵生产阿卡波糖的发酵动力学模型。应用OriginPro 8软件对模型参数估计和非线性曲线拟合。非线性规划得到的3个发酵动力学的数学模型为:菌体生长动力学模型dX/dt= 7.9×10-2（1-X/29.05）产物生长动力学模型 dP/dt=11.59×dX/dt+1.13X底物消耗动力学模型-dS/dt=1.2dX/dt+7.2×10-3dP/dt

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 糖尿病及其并发症
• 1.1.1 糖尿病治疗药物
• 1.2 阿卡波糖的研究进展
• 1.2.1 阿卡波糖的化学结构与理化性质
• 1.2.2 阿卡波糖的作用机理
• 1.2.3 阿卡波糖的生物合成
• 1.3 国内外阿卡波糖发酵研究进展
• 1.3.1 阿卡波糖产生菌的生长与阿卡波糖合成的关系
• 1.3.2 培养基对发酵的影响
• 1.3.3 培养条件对阿卡波糖发酵的影响
• 1.3.4 补料发酵工艺
• 1.4 本文研究目标和思路
• 参考文献
• 第二章 阿卡波糖分析方法的确定及其产生菌株的鉴定与选育
• 引言
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要药品与试剂
• 2.1.3 主要实验室设备与仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 相关溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养方法
• 2.2.2 阿卡波糖液相检测方法的确定
• 2.2.3 菌种保藏
• 2.2.4 菌种鉴定
• 2.2.5 阿卡波糖产生菌的自然选育
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 阿卡波糖液相检测方法的分析
• 2.3.2 形态学鉴定
• 2.3.3 分子生物学鉴定
• 2.3.4 自然选育
• 2.3.5 菌种稳定性测定
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 阿卡波糖产生菌发酵条件优化
• 引言
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要实验仪器及设备
• 3.1.3 主要实验药品及试剂
• 3.1.4 主要试剂配制
• 3.1.5 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 培养方法
• 3.2.2 阿卡波糖分析方法
• 3.2.3 生物量的测定
• 3.2.4 pH测定
• 3.2.5 发酵液残糖的测定——苯酚硫酸法[]
• 3.2.6 葡萄糖和谷氨酸钠的测定
• 3.2.7 渗透压的测定
• 3.2.8 组分C的测定
• 3.2.9 数据处理
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 葡萄糖标准曲线的测定
• 3.3.2 种子生长曲线、种龄和接种量的确定
• 3.3.3 发酵培养基成分的优化
• 3.3.4 发酵条件的优化
• 3.3.5 培养基中添加前体物质对阿卡波糖生物合成的影响
• 3.3.6 发酵液中组分C的变化
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 A.utahensis ZJB-08196补料发酵工艺研究
• 引言
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 主要仪器与设备
• 4.1.3 主要实验药品及试剂
• 4.1.4 主要试剂配制
• 4.1.5 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 培养方法
• 4.2.2 其余分析方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 渗透压调节对阿卡波糖合成的影响
• 4.3.2 补料对发酵生产阿卡波糖的优化研究
• 4.3.3 摇瓶补料发酵曲线
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 Actinoplanes utahensis ZJB-08196摇瓶发酵动力学
• 引言
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 主要仪器与设备
• 5.1.3 主要实验药品及试剂
• 5.1.4 主要试剂配制
• 5.1.5 培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 培养方法
• 5.2.2 其余分析方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 摇瓶发酵代谢曲线
• 5.3.2 动力学模型的建立
• 5.3.3 模型拟合分析
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文及专利情况