镉污染对放线菌生物活性和种群结构的影响及镉生物吸附研究

论文摘要

本项目以华家池旱地黄松田土壤为研究材料,运用现代分子生物学手段,采用室内培养及统计分析相结合的方法,全面探讨了镉胁迫对旱地土壤放线菌生态多样性的影响,并以土传致病菌-番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,Cmm）为供试菌株,分析筛选到的1株对Cmm具有较强抑制作用的放线菌HL-12（Streptomyces vinaceus）受镉胁迫在纯培养条件下及在无菌土壤环境中对Cmm的抑制效果。此外还分离到1株对镉具有较强抗性的放线茵K33（Streptomyces psammoticus）,对2株放线菌在镉污染水环境中对镉的生物吸附动力学及其吸附机理作了初步研究和比较,为建立有效的重金属污染预警指标体系、环境质量评价及抗镉微生物的有效利用提供有益的参考。本研究所获主要结论如下:1采用现代分子生态学手段研究了镉胁迫对旱地土壤中放线菌生态多样性的影响。在培养初期镉对放线菌种群毒害作用较为明显,与对照相比,许多条带消失,基因多样性下降,到了培养后期,不同处理间的基因多样性差异逐渐缩小,数量上仍存在一定差异。在含0.5～1.0 mg·kg-1镉的培养初期DGGE图谱中出现特异性条带,为对照和高浓度镉处理样品中所没有,经序列测定及与GenBank中核酸数据进行比对分析,与Rhodococcus sp.M51-3.3具有很高的相似性,以该序列代表菌株用来检测土壤低浓度镉污染具有一定的可行性。另有一条特异性DGGE条带只出现在对照样品中,经序列测定及与GenBank中核酸数据进行比对分析,与Streptomyces sp.343E07具有很高的相似性,说明该条带代表菌株对镉较为敏感,可以作为一种镉污染环境中的特征性菌株。2从浙江台州一废弃铅锌尾矿土壤和浙江大学华家池一处未遭受重金属污染的旱地土壤中分别分离纯化获得1株可在含镉300mg·1-1的LB培养基中正常生长的抗镉放线菌株和对Cmm具有较强抑制作用的放线菌。通过对2菌株进行形态观察、培养特征、生理生化特性分析、细胞壁化学组分分析及16S rRNA基因序列同源性比较,利用DNAStar软件进行系统发育地位分析,构建系统进化树,鉴定其分别属于Streptomyces psammoticus和Streptomycesvinaceus。重金属抗性实验表明,菌株K33对铅和锌具有良好的抗性,对铜的耐受性较差。利用圆纸片法测定菌株HL-12的发酵粗提液对Cmm的抑制作用,直径可达11mm,利用琼脂块平板法测定活菌活性,直径大小为13 mm。此外,菌株HL-12对革兰氏阳性菌具较强的抑制作用,对革兰氏阴性菌的抑制性较弱,对稻瘟病菌（真菌）无拮抗作用。3研究了纯培养及灭菌土壤环境中,镉对菌株HL-12抑菌活性的影响。结果显示适宜浓度镉胁迫下,促进放线菌的次生代谢过程,增强其抑菌活性,当镉浓度超过菌体自身调节作用,则对菌体产生一定的毒害作用,影响其次生代谢过程,进而对其抑菌活性产生负面效应。添加Ca2+,在一定程度上可以缓解镉对菌株的毒害作用。添加低浓度Ca2+有利于菌株抑制Cmm生长,高浓度Ca2+降低菌株HL-12对Cmm的抑制作用。在灭菌土壤中,超过土壤镉污染临界点的浓度(1.0 mg·kg-1),菌株HL-12对Cmm仍具有一定的抑制效果,只有在镉离子浓度超过污染临界值3～5倍左右时,才会对菌株HL-12的抑菌活性产生一定的影响。4研究了2分离菌株HL-12和K33对镉离子的吸附动力学。结果表明菌株K33在镉污染水环境中的吸附能力较菌株HL-12要强。在pH为6.0,菌体浓度为2.0～2.5g·l-1的条件下,一定浓度镉溶液中处理60 min,菌株K33的最大吸附量为1.98 mol·g-1,菌株HL-12的最大吸附量为1.14 mol·g-1。Langmuir,Freundlich和Dubinin-Radushkevich（D-R）3个等温吸附模型对实验数据均可以进行较好的模拟,Langmuir与实验数据拟合效果最好。二级动力学模型能较好地模拟整个吸附过程。在pH值为2.0时,菌株K33的解吸率达70%左右,可以作为生物吸附剂处理低浓度镉污染水体。5初步研究了放线菌对镉的生物吸附及耐受性机理。细胞中DNA、蛋白质、多糖、脂类4类主要组分对镉离子的吸附具有较大差异。菌株K33和HL-12细胞中均以蛋白质结合态镉为主要存在形式,脂类和多糖结合态镉的存在比例相当,以DNA结合态镉存在形式最少。透射电镜观察结果显示,镉对菌株HL-12形态影响较大,添加镉后菌株HL-12体积变小,胞囊壁呈现变形虫状,胞内透明,胞囊增大,许多细胞出现了表面破裂、细胞变形等情况。菌株K33胞内胞囊变化不明显,添加镉后,个别细胞出现破裂,表面出现裂痕,但仍保持完整。富镉菌体颜色较无镉菌体浅,较高浓度镉培养下的菌体表面较为粗糙,且有较大的结晶颗粒附着其上。FT-IR方法分析了2菌株细胞表面的功能团对镉离子的螯合特性,结果表明2菌株中结合镉离子的可能功能团为O-H,N-H,C=O,C-O,这些基团基本集中在蛋白质和糖类物质,且菌株HL-12表面结构改变较大。

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ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 放线菌

1.1.1 放线菌的概述

1.1.2 放线菌的分类

1.1.3 链霉菌属

1.2 土壤重金属污染

1.2.1 土壤重金属镉污染现状

1.2.2 重金属污染的特点

1.2.3 重金属镉污染来源

1.2.4 重金属镉对人类和生态环境的危害

1.3 重金属污染对土壤微生物生态多样性的影响

1.4 微生物分子生态学的研究进展及其在污染环境中的应用

1.4.1 环境样品中总DNA的提取

1.4.2 16S rRNA的PCR扩增

1.4.3 基于PCR技术的研究方法

1.4.4 分子生态学技术在环境微生物研究中的应用

1.5 重金属对微生物的毒性作用及影响因素

1.6 微生物技术在重金属污染土壤生物修复中的应用

1.6.1 微生物对重金属的生物吸收作用

1.6.2 微生物对重金属的沉淀作用

1.6.3 微生物对重金属的生物转化作用

1.6.4 影响微生物修复效应的因素

1.6.5 微生物修复面临的问题与展望

1.7 基因工程技术及其展望

1.8 本研究的目的与意义

第二章生防和抗镉放线菌株的分离鉴定

2.1 引言

2.2 试验材料与方法

2.2.1 菌株分离源

2.2.2 主要实验试剂

2.2.3 主要实验仪器

2.2.4 培养基

2.2.5 试验设计与方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 菌体的形态及培养特征

2.3.2 菌株的生理生化特性

2.3.3 菌株的细胞壁化学类型

2.3.4 菌株的16S rRNA基因序列分析

2.3.5 菌株HL-12的拮抗性试验

2.3.6 菌株的抗生素敏感性试验

2.3.7 菌株K33对重金属的耐受性

2.3.8 菌株K33在镉离子胁迫下的生长特性

2.4 小结

第三章重金属镉胁迫下放线菌生物学活性的变化研究

3.1 引言

3.2 试验材料与方法

2+胁迫对Cmm的抑制效果'>3.2.1 纯培养条件下菌株HL-12受Cd²⁺胁迫对Cmm的抑制效果

3.2.2 镉胁迫下菌株HL-12在土壤中对Cmm的抑制效果

3.3 结果与讨论

3.3.1 纯培养条件下菌株HL-12在镉胁迫下对Cmm的抑制作用

3.3.2 镉胁迫下菌株HL-12在土壤中对Cmm的抑制活性变化

3.4 小结

第四章镉胁迫下土壤放线菌基因多样性DGGE指纹图谱分析

4.1 引言

4.2 试验材料与方法

4.2.1 供试土壤

4.2.2 试验设计与方法

4.2.3 土壤总DNA提取

4.2.4 PCR扩增

4.2.5 变性梯度凝胶电泳（DGGE）及染色

4.2.6 凝胶指纹图谱的生物信息学分析

4.2.7 特异性条带的割胶回收

4.2.8 克隆和序列分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 土壤微生物总DNA的提取和PCR扩增结果

4.3.2 镉胁迫下土壤总DNA的DGGE指纹图谱分析

4.3.3 DGGE条带的Shannon指数和主成分分析

4.3.4 特异性条带测序和比对结果分析

4.4 小结

第五章放线菌对镉的生物吸附及其动力学研究

5.1 引言

5.2 试验材料与方法

5.2.1 试验菌株及培养条件

5.2.2 吸附菌株的处理

5.2.3 重金属镉的测定

5.2.4 重金属镉吸附实验

5.2.5 重金属镉的解吸实验

5.3 结果与讨论

5.3.1 pH和温度对镉生物吸附的影响

5.3.2 等温吸附模型的模拟

5.3.3 吸附动力学研究

5.3.4 pH对解吸效率的影响

5.4 小结

第六章放线菌对镉生物吸附机理的初步研究

6.1 引言

6.2 试验材料与方法

6.2.1 试验菌株

6.2.2 主要实验试剂

6.2.3 主要实验仪器

6.2.4 培养基

6.2.5 试验方法设计

6.3 结果与讨论

6.3.1 菌株不同细胞组分对镉吸附的差异

6.3.2 菌株连续培养过程中溶液pH的变化

6.3.3 加镉前后试验菌株细胞形态的变化

6.3.4 红外光谱分析

6.4 小结

论文的主要研究结论及展望

1.全文主要研究结论

2.创新点

3.论文的不足与展望

参考文献

博士研究生学习期间论文发表及获奖情况

镉污染对放线菌生物活性和种群结构的影响及镉生物吸附研究

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