产碱性果胶酶菌株的原生质体融合育种

论文摘要

碱性果胶酶是重要的工业用酶之一,在现在的生物技术领域发挥着重要作用,广泛地应用于纺织工业、植物韧皮的脱胶、造纸、饲料工业等方面。 本论文所用菌种是从内蒙古海拉尔地区的碱湖中筛选得到两株产碱性果胶水解酶的嗜盐嗜碱菌。菌株Alkalibacterium sp.F26生长速度稍慢,但产酶水平高;Bacillus sp.F26生长速度稍快,但产酶水平低。本课题通过把这两株产碱性果胶酶的细菌进行原生质体融合来改良菌株性质,筛选出生长速度较快、酶产量更高的新菌株。 用亚硝基胍诱变获得链霉素抗性突变株Alkalibacterium sp.F26-52,其产酶量比未诱变的出发菌提高13.6%;紫外线诱变获得氯霉素抗性突变株Bacillussp.F26-37,其产酶量比未诱变的出发菌提高15.2%。且它们获得遗传标记是稳定的。 将上述两株菌作为亲本菌株,通过原生质体融合,采用选择性培养基对融合菌株进行10代传代培养后,成功筛选出3株高产融合子,其中,有2株生长速度和产酶量均超过亲本菌株Alkalibacterium sp.F26-52。同时本文对3株高产融合子和亲本菌株进行了生理生化特征的比较和研究。 在所有获得的融合菌株中,融合子11#产酶量最高。对融合子11#发酵产碱性果胶酶的培养基和培养条件进行了优化。考察了碳源、氮源、无机盐、表面活性剂及起始pH、发酵时间、温度等发酵条件的影响。经单因素和响应面分析试验得到适宜的发酵培养基为:葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L,硝酸钠1.7g/L,NaCl 65g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,K2HPO4·3H2O 1g/L,NaCO3 10g/L,吐温8010g/L;培养条件为:250mL三角瓶装液量25mL,36℃,起始pH10.8,培养22h。在此优化条件下培养,酶活达1308U/mL,比原始菌株Alkalibacterium sp.F26高出28.9%,比原始菌株Bacillus sp.F26高出115.8%。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 极端酶
• 1.2 碱性果胶酶
• 1.3 原生质体融合
• 第二章 Alkalibacterium sp.F26发酵产酶的条件优化
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 培养基主组份对 Alkalibacterium sp.F26产酶的影响
• 2.2.2 不同添加物对Alkalibacterium sp.F26产酶的影响
• 2.2.3 培养条件对 Alkalibacterium sp.F26产酶的影响
• 2.2.4 组合优化实验及结果
• 2.2.5 摇瓶发酵过程曲线
• 2.3 小结
• 第三章 抗性标记菌株的获得
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 亚硝基胍诱变获得 Alkalibacterium sp.F26链霉素抗性标记突变株
• 3.2.2 紫外线诱变 Bacillus sp.F26获得氯霉素抗性突变株
• 3.2.3 菌株自发突变率实验
• 3.3 小结
• 第四章 原生质体融合及融合子的鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 影响原生质体形成的因素
• 4.2.2 原生质体融合
• 4.2.3 原生质体检出
• 4.2.4 融合子产酶和生长速度情况
• 4.2.5 融合子和亲本菌株的对比
• 4.3 小结
• 第五章 融合子与原始菌株产酶条件和酶学性质的对比
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 融合子产酶发酵条件优化
• 5.2.2 融合子与原始菌株碱性果胶酶粗酶部分酶学性质的对比
• 5.3 小结
• 主要结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文清单