论文摘要
研究背景与意义结直肠癌（Coloretal carcinoma, CRC）是全世界癌症发病率列第3位的恶性肿瘤,每年新发病例120万人,预计死亡病例超过60万人,我国结直肠癌占恶性肿瘤发病率的第2位,占肿瘤死亡率的第4位。近几年来,虽然随着诊疗新技术的应用和化疗药物的不断更新,结直肠癌患者的治疗得到了极大地改善,但患者的生存率并没有明显地提高,主要原因是一半以上的结直肠癌患者在行根治性手术前已出现了微转移,复发与转移是结直肠癌患者术后死亡的主要原因。因此,有必要加强结直肠癌转移分子机制的基础研究,筛选和鉴定在结直肠癌转移过程中起重要作用的关键分子,针对特异性标记物进行靶向干预和治疗,是有效提高结直肠癌患者生存率和治愈率的重要措施。肿瘤转移是一个复杂的、多步骤的阶段演变过程。肿瘤细胞要完成转移过程,必须经历从原发瘤脱落、进入血管和／或淋巴管、在循环中生存、黏附于继发器官微血管、渗出血管和／或淋巴管、进入继发器官组织、形成微转移瘤并诱发血管发生,最终形成转移瘤,任一环节的中断均不能形成转移瘤。肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSC）与肿瘤转移关系密切,是原发瘤与转移瘤形成必须依赖的起始细胞,信号通路的交替调节和微环境因子诱导CSC的定向迁移,促进肿瘤扩展、蔓延和转移。因此,对抗CSC的定向迁移,建立控制肿瘤蔓延和侵袭的生物屏蔽体系,使肿瘤局限于原发部位,不发生局部侵袭和远处转移,是抗肿瘤转移研究开创性的全新研究模式。CSC具有正常干细胞特性,维持干细胞特性的基因终生存在。CSC具有自我更新和分化能力,相对静息性和放化疗抵抗性[44],即使在治疗十年以上,只要CSC未能清除,肿瘤仍将复发与转移。CSC一方面在原发部位微环境因素适合于分裂、分化的情况下,大量产生子代细胞,使肿瘤扩大；另一方面,进入血管与淋巴管内的CSC,寻求合适或诱导机体产生相应的微环境,最终滞留于靶器官,增殖分化形成转移瘤,这一过程可在短期内或长达十年完成。转移瘤内分离出具有自我更新与分化能力的CSCN和转移瘤内部分细胞具有CSC的表型特征,说明转移瘤的形成同样依赖CSC的存在。在预测具有迁移能力的CSC存在之后,相继发现了胰腺癌和结直肠癌的转移性肿瘤干细胞（metastatic cancer stem cells, MCSC）,不同CSC亚群或同一细胞系来源的不同CSC亚克隆,转移潜能不同,提示CSC同样具有转移潜能的异质性。如果针对CSC的表型特异性进行靶向治疗,有望根除恶性肿瘤；清除具有转移特性的CSC、消除CSC的转移潜能,可使肿瘤局限于原发部位,防止恶性肿瘤的扩散和转移。课题组前期已经筛选出结直肠癌（MCSC即17CSC）与非转移肿瘤干细胞（nMCSC即40CSC）,比较两种类型CSC表型分子的差异性,发现氯离子细胞内通道蛋白4（Chloride intracellular channel protein4, CLIC4）和MCSC相关,影响CSC的转移行为,提示与细胞的迁移行为有关。本研究进一步探讨CLIC4的相互作用蛋白及其诱导CSC迁移的分子机制,期望靶向对抗CLIC4及其相互作用蛋白而抑制肿瘤转移。方法1.结直肠癌干细胞中CLIC4相互作用蛋白的筛选（1）利用有免疫共沉淀方法、质谱鉴定、生物信息学方法、文献挖掘筛选出与CLIC4相互作用蛋白。（2）应用Western Blot、RT-PCR检测母系SW48017、40、17CSC及40CSC的表达这些相互作用蛋白和情况。（3）利用激光共聚焦显微镜检测这些蛋白与CLIC4是否存在共定位。2. CLIC4相互作用蛋白的鉴定运用基于蛋白质水平的谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白沉淀、免疫共沉淀和共定位分析等技术对质谱鉴定初步筛选的结果进行体内和体外的验证。（1）谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白沉淀（GST-pull down）分别构建CLIC4的原核表达载体pGEX-4T-1-CLIC4和PHB的原核表达载体Pet32A-PHB,通过诱导表达,纯化,获得带有GST标签的CLIC4融合蛋白和带有His标签的PHB融合蛋白。运用GST-pull down技术在体外对CLIC4与PHB的相互作用进行验证。（2）免疫共沉淀（CO-Immunoprecipitation, CO-IP）前期已经内源性体免疫共沉淀筛选出CLIC4的相互作用蛋白PHB,更进一步从外源性免疫共沉淀进行证实。分别构建带有FLAG和HA蛋白表位标签的CLIC4和PHB的真核表达载体,两种载体共转染293T细胞,通过琼脂糖微珠进行免疫复合物共沉淀,再以抗HA和抗FLAG的抗体行Western blot检测,确定外源性的CLIC4和PHB是否存在相互作用（3）共定位分析将PLVTHM-FLAG-CLIC4和PLVTHM-HA-PHB共转染293T细胞。转染48h后,利用不同种属来源的抗FLAG和抗HA抗体进行免疫荧光双标记,分别在激光共聚焦显微镜下观察外源性的CLIC4和PHB在无关细胞体内是否存在共定位现象。运用免疫荧光双标记方法对结直肠癌干细胞内的CLIC4和PHB蛋白进行共定位分析,确定内源性的两种蛋白是否存在共定位情况。（4） CLIC4和PHB相互作用的位点利用生物信息学分析和文献挖掘,分析CLIC4与PHB的功能结构区,各自设计3个突变体,利用免疫沉淀技术（IP）,获得CLIC4与PHB相互作用位点。3. CLIC4、PHB的表达及功能验证（1）应用免疫组化检测在具有10年完整随访资料的400例临床结直肠癌标本对CLIC4和PHB在蛋白质水平上的表达情况进行了研究,并对两个蛋白与患者的临床特征包括性别、年龄、病理学分期、临床分级、转移及预后等进行了综合研究。（2）设计并构建pLVTHM-PHB慢病毒表达载体,进行病毒包装后将之感染至结直肠癌干细胞40CSC中,用慢病毒空载体做对照,利用有限稀释法筛选并获得pLVTHM-PHB过表达的单克隆稳定干细胞,用Western blot检测转染效率。（3）设计PHB的干扰片段,合成siRNA,利用阳离子脂质体法将之转染17细胞。Q-PCR和Westem blot鉴定各干扰片段干扰效率,选择干扰效率最高的片段构建慢病毒载体,将商品化的PHB-homo-649干扰病毒感染17CSC细胞,用慢病毒空载体做对照,利用有限稀释法筛选并获得PHB干扰的单克隆稳定细胞株,用Western blot检测转染效率。（4）利用MTT法、平板克隆形成和体外侵袭和迁移实验,检测CLIC4和PHB过表达和干扰以及同时干扰和（或）过表达CLIC4和PHB后对体外干细胞增殖、侵袭能力的影响。（CLIC4干扰和过表达干细胞为本课题组前期成果）（5）利用裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射实验,检测分别干扰（或过表达）CLIC4和PHB以及同时干扰和（或）过表达CLIC4和PHB对皮下成瘤能力和肺播散性转移能力的影响。4. CLIC4与PHB相互作用诱导结直肠癌肿瘤干细胞的迁移及其机制（1）利用Westem blot检测CLIC4和PHB的表达是否影响干细胞的表型；免疫荧光检测新鲜结直肠癌新鲜组织里CLIC4、PHB与ALDH1的共定位关系。（2）利用Westem blot检测CLIC4、PHB对凋亡通路蛋白的影响；（3）利用Westem blot检测CLIC4、PHB对EMT的影响（4）利用激光共聚焦显微镜,检测PHB诱导细胞骨架蛋白F-actin和microtuble重组,检测新鲜结直肠癌新鲜组织内PHB和F-actin的共定位关系。（5）利用Westem blot检测分析细胞骨架合成调节因子与CLIC4、PHB表达的相关性。结果：1.结直肠癌干细胞中CLIC4相互作用蛋白的筛选（1）初步筛选出PHB、RPL7A、MACF1、SMARCA5、XRCC5五个蛋白可能与CLIC4有相互作用。（2） Western Blot、RT-PCR检测显示PHB、RPL7A、MACF1、SMARCA5. XRCC5在母系SW480、17、40、17CSC及40CSC中均表达。（3）激光共聚焦显微镜结果显示,内源性的PHB、RPL7A、MACF1与CLIC4存在共定位,SMARCA5只有在有丝分裂的细胞中与CLIC4才存在共定位,XRCC5与CLIC4不存在共定位。运用生物信息学方法和文献挖掘确定了PHB为深入研究对象。2. CLIC4与PHB相互作用的进一步鉴定（1）谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白沉淀（GST-pull down）实验进一步从体外证实了CLIC4与PHB存在直接相互作用。（2）外源性免疫共沉淀实验也证实了CLIC4与PHB有相互作用。（3）外源性的CLIC4和PHB蛋白存在共定位关系,共定位的Pearson’s系数为0.94。（4）IP实验证实了CLIC4的67-100氨基酸区域与PHB的74-116氨基酸区域相互结合诱发生物学效应。3. CLIC4、PHB的表达及功能验证（1）免疫组化结果显示,从表达方式上来看,发现仅有少量癌细胞表达（与CSC占肿瘤细胞群的1/1000-1/100相一致） CLIC4和PHB；结合临床随访资料分析,患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤大小与两种蛋白的表达均无统计学意义（P>0.05）。CLIC4的表达和患者的临床分期有显著相关性（P=0.001）；CLIC4的表达与患者术后生存时间的相关性分析结果表明：高表达组的术后生存时间较低表达组明显缩短,并且差异具有显著性（P<0.05）。PHB与患者肿瘤部位有统计学意义（P=0.006）；统计分析显示,PHB与血管侵犯有关（P=0.04）。（2） Western Blot检测稳定过表达PHB的40CSC、40CSC-CLIC4、17CSC-siCLIC4.40细胞,结果显示,与mock、blank组相比,这几组细胞PHB的表达明显增高。（3） Western Blot检测稳定干扰PHB的17CSC、17CSC-siCLIC4、40CSC-CLIC4细胞及17细胞,结果显示,与mock、blank组相比,这几组细胞PHB的表达明显降低。（4）MTT实验和软琼脂集落形成实验结果分别显示,与mock组相比,CLIC4敲低后,细胞的增殖速度减慢（P<0.001,P<0.001）；而PHB敲低后,细胞的增殖速度增快（P<0.001,P<0.001）。与mock组相比,CLIC4过表达后,细胞的增殖速度增快（P<0.001,P<0.001）；而PHB敲低后,细胞的增殖速度减慢（P<0.001,P<0.001）。（5）体外侵袭和迁移实验结果显示：与mock组相比,CLIC4、PHB敲低后,细胞的侵袭和迁移下降（P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001）；与mock组相比,CLIC4、PHB过表达后,细胞的侵袭和迁移增强（P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001）。（6）裸鼠皮下成瘤试验和裸鼠尾静脉注射结果显示：CLIC4过表达显著提高了结直肠癌干细胞的体内增殖能力（P<0.05）和肺转移能力（肺转移率从0提高到100%）,CLIC4干扰后显著降低了结直肠癌CSC的体内增殖能力（P<0.05）和肺转移能力（肺转移率从100%降低到20%）；PHB干扰后显著降低了结直肠癌CSC的体内增殖能力（P<0.05）和肺转移能力（肺转移率从100%降低到66.7%）,过表达PHB后不能在裸鼠皮下形成肿瘤,亦不能形成肺转移瘤。4. CLIC4与PHB相互作用诱导结直肠癌肿瘤干细胞的定向迁移及其机制（1） Western Blot检测结直肠癌CSC标记物CD133、CD44、EpCAM、ALDH1,结果表明,过表达CLIC4或PHB后,CD133、CD44、EpCAM、ALDH1表达增高；干扰CLIC4或PHB后CD133、CD44、EpCAM、ALDH1表达降低,免疫荧光检测结直肠癌新鲜组织标本结果显示：CLIC4与ALDH1、PHB与ALDH1有共定位关系,且迁移到腺腔外的癌细胞强表达CLIC4、PHB与ALDH1。（2） Western Blot检测凋亡相关蛋白,结果显示：干扰PHB或过表达CLIC4后,凋亡相关蛋白caspase2、caspase3、DFF45、Fas、RIP表达明显减弱,caspase家族底物PARP表达增强；而过表达PHB或干扰CLIC4之后,凋亡相关蛋白caspase2、 caspase3、DFF45、Fas、RIP表达增强,caspase家族底物PARP表达减弱。（3） Western Blot检测EMT相关蛋白,结果显示：过表达CLIC4或PHB后,细胞中表达的间质性标记物如N-cadheri、Vimentin增高,而上皮性标记物如上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）表达降低。（4）免疫荧光检测结果表明,PHB与细胞骨架蛋白F-actin、Microtubule都存在共定位。干扰CLIC4或PHB后,细胞架蛋白F-actin表达减弱,微丝减少,Microtubule表达也减弱；过表达CLIC4或PHB后,细胞架蛋白F-actin表达增强,微丝增多,Microtubule表达也增强。PHB与F-actin在结直肠癌新鲜标本也存在共定位,且迁移到腺腔外的癌细胞强表达PHB与F-actin。（5） Western Blot检测过表达与干扰PHB/CLIC4的结直肠癌CSC,细胞内ROCK、LIMK、Cofilin表达发生改变,而ROCK、LIMK、Cofilin是细胞内骨架解聚的重要调节因子,提示CLIC4-PHB相互作用参与调节细胞骨架的重组,诱导细胞迁移。结论1.结直肠癌CSC中PHB与CLIC4相互作用诱导CSC的迁移及转移。2.PHB与CLIC4相互作用,影响细胞骨架蛋白F-actin和微管的重组与细胞内的再分布。CLIC4的67-100氨基酸区域与PHB的74-116氨基酸区域相互结合诱发生物学效应。3. CLIC4与PHB相互作用于ROCK/LIM信号通路,参与F-actin合成与解聚的动态过程调节,改变细胞的运动状态,但其具体作用机制与网络节点尚需深入探讨。4.PHB还参与细胞凋亡的调节,高表达PHB后,促进细胞凋亡,抑制CSC的成瘤性,提示PHB与CLIC4的协同作用还受其它因素的影响。5. CLIC4高表达预示着结直肠癌患者的不良预后,PHB在结直肠癌组织内表达呈CSC表达特性,与肿瘤细胞的血管侵袭有关,提示为CLIC4-PHB相互作用促进CSC向肿瘤间质内的血管系统浸润。本研究的创新之处1.确定了CLIC4的相互作用蛋白PHB以及它们相互作用的位点。2. CLIC4与结直肠癌转移预后密切相关,PHB促进结直肠癌细胞侵犯血管。3.发现CLIC4与PHB相互作用,调节结直肠癌CSC细胞骨架重组,促进CSC的侵袭和转移。