绿僵菌侵染相关基因Magas1的克隆和功能分析

论文摘要

绿僵菌（Metarhizium acridum）属于半知菌亚门绿僵菌属,是一种致病力强的昆虫病原真菌,具有对人、畜、农作物等无毒,无残毒、菌剂易生产及持效期长等优点,具有广阔的应用前景。附着胞是昆虫病原真菌重要的侵染结构,在绿僵菌成功侵染寄主一系列复杂的过程中,孢子萌发并分化形成附着胞是关键.本实验室已构建了绿僵菌在附着胞形成阶段的均一化cDNA文库,本研究从该文库中挑选了一个附着胞期间特异表达的基因Magas1,克隆了该基因的全长cDNA序列（GenBank登陆号:DQ496227）,生物信息学分析显示该基因编码317个氨基酸,含有954bp ORF框,同源性分析结果表明,Magas1编码的蛋白质与Aspergillus fumigatus中的mas1（XP747144）及Magnaporthe grisea中的gas2（AF26- 4035）等均有很高的同源性。半定量RT-PCR分析结果显示该基因在附着胞期间表达量最高,在孢子萌发初期及菌丝时期亦有低水平的表达,在其它时期如体内菌丝时期、培养基上产孢时期及虫体体表产孢时期几乎不表达。以Magas1基因的启动子构建的Magas1-EGFP融合表达载体,通过激光共聚焦显微镜检测发现到绿色荧光融合蛋白定位于附着胞的细胞质。将该基因敲除后,与野生型相比,Magas1基因突变株在1/4SDAY培养基上产孢结构生成延迟,而两者在孢子萌发率及附着胞形成率上并无显著差异。毒力测试结果表明突变菌株对东亚飞蝗的毒力比野生型显著下降,说明Magas1是绿僵菌的一个毒力因子,而突变菌株膨胀压下降表明影响真菌穿透寄主体表。对该基因的深入研究有助于了解昆虫病原真菌的形成及侵入机理。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 1 绪论
• 1.1 研究背景与意义
• 1.2 绿僵菌的研究现状
• 1.2.1 绿僵菌的生物学特征
• 1.2.2 绿僵菌的致病机理
• 1.3 附着胞的研究进展
• 1.3.1 附着胞的形态及结构
• 1.3.2 附着胞的主要功能
• 1.3.3 附着胞形成的信号转导机制
• 1.4 立题依据和研究目标
• 1.5 研究内容和技术路线
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 技术路线
• 1.6 本研究创新之处
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 所用菌株和昆虫
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液配制
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.2 Magas1 全长cDNA 基因的克隆及相关序列分析
• 2.2.1 Magas1 全长cDNA 的克隆
• 2.2.2 Magas1 基因cDNA 序列的分析
• 2.2.3 Magas1 基因组DNA 及启动子序列的分析
• 2.3 Magas1 基因表达谱分析
• 2.3.1 绿僵菌CQMa102 腐生及寄生各个时期样品制备
• 2.3.2 绿僵菌CQMa102 腐生及寄生各个时期RNA 的提取
• 2.3.3 半定量RT-PCR.
• 2.4 Magas1 基因表达定位分析
• 2.4.1 Pbar-EX -EGFP 载体的构建
• 2.4.2 Magas1-EGFP 初步载体的构建.
• 2.4.3 Magas1-EGFP 农杆菌融合表达载体的构建
• 2.4.4 Magas1-EGFP 农杆菌融合表达载体转化绿僵菌
• 2.4.5 筛选Magas1-EGFP 绿僵菌转化菌株.
• 2.4.6 激光共聚焦显微镜观察Magas1-EGFP 的表达定位
• 2.5 Magas1 基因敲除突变菌株的筛选
• 2.5.1 Magas1 基因敲除载体的构建
• 2.5.2 Magas1 基因敲除载体转化绿僵菌
• 2.5.3 筛选Magas1 绿僵菌突变株
• 2.6 Magas1 基因功能的研究.
• 2.6.1 1/4SDAY 培养基上生长速度观察
• 2.6.2 各种培养基上菌落的形态特征
• 2.6.3 1/4SDAY 培养基上产孢量的测定
• 2.6.4 萌发率及附着胞形成率的测定
• 2.6.5 膨胀压测定
• 2.6.6 毒力测试
• 2.6.7 数据处理
• 3 结果和分析
• 3.1 Magas1 基因cDNA 全长的克隆及序列分析
• 3.1.1 Magas1 基因cDNA 全长的克隆
• 3.1.2 Magas1 基因cDNA 全长的序列分析
• 3.2 Magas1 基因表达时期分析
• 3.2.1 腐生及寄生各个时期RNA 的提取
• 3.2.2 半定量RT-PCR 分析表达时期
• 3.3 Magas1 基因表达定位分析
• 3.3.1 Magas1 启动子、Magas1 基因及EGFP 基因的扩增
• 3.3.2 Magas1-EGFP 融合表达载体的验证.
• 3.3.3 Magas1-EGFP 转化菌株的筛选.
• 3.3.4 荧光观察Magas1-EGFP 转化菌株的表达定位
• 3.4 Magas1 敲除突变株的筛选
• 3.4.1 Magas1 基因敲除载体左臂及右臂的扩增
• 3.4.2 Magas1 基因敲除载体的验证
• 3.4.3 筛选Magas1 基因敲除突变株
• 3.5 Magas1 的基因功能研究
• 3.5.1 1/4SDAY 培养基上生长速度观察.
• 3.5.2 各种培养基上菌落的形态特征
• 3.5.3 1/4SDAY 培养基上产孢量测定
• 3.5.4 萌发率及附着胞形成率的测定
• 3.5.5 膨胀压测定
• 3.5.6 毒力测试
• 4 讨论
• 4.1 筛选cDNA 文库的方法获取Magas1 基因的cDNA 全长.
• 4.2 Magas1 表达时期及表达定位分析
• 4.3 Magas1 的功能分析
• 5 结论与后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录.
• A. 本文中用到的引物
• B. 作者在攻读学位期间发表的论文目录