根瘤菌新种Rhizobium taibaishanense的多相分类研究

论文摘要

本课题组已利用16S rDNA PCR-RFLP、recA基因序列分析等多相分类技术对从西北部分地区分离获得的53株鸡眼草根瘤菌进行了多样性研究,发现由4株菌组成的一个根瘤菌群属于Rhizobium,但不同于Rhizobium内的已知种,从而推测它们可能是新种。为确定它们的具体分类地位,在本研究中我们对该拟定根瘤菌新种群进行了持家基因序列分析、rep-PCR指纹图谱分析、DNA同源性分析以及表型性状研究。另外,我们还研究了它们的共生特性和植物致病性。在16S rDNA全序列分析结果中,拟定根瘤菌新种群属于Rhizobium,与R. vitis的序列相似性最高,为99.3%,且构成独立的分支,初步判断该拟定根瘤菌新种为Rhizobium内的根瘤菌新种。recA和glnA基因的序列分析结果表明,拟定根瘤菌新种群同样属于Rhizobium,这与16S rDNA序列分析结果是一致的。拟定根瘤菌新种群的recA和glnA基因序列与Rhizobium内的已知种的序列相似性分别低于86.5%和88.9%。低的基因序列相似性,进一步明确了供试根瘤菌的新种地位。rep-PCR指纹图谱分析结果表明,拟定根瘤菌新种群与参比菌株在20%的相似性水平上聚在一起,说明拟定根瘤菌新种群不同于参比菌株;而拟定根瘤菌新种群在66%的相似性水平上聚在一起,说明它们并非同一株菌的克隆。DNA同源性分析结果表明,拟定根瘤菌新种群的G+C mol%在58.0-59.2 mol%之间,符合Rhizobium的G+C mol%范围;中心菌株CCNWSX 0483T与参比菌株R. vitis IAM 14140T同源率为40.13%,低于发表根瘤菌新种的标准（70%）。表型特征研究结果表明,拟定根瘤菌新种群内各菌株之间以及与参比菌株之间存在27项生理生化性状差异;拟定根瘤菌新种群与参比菌株在数值分类图中以42%的相似水平聚在一起;CCNWSX 0483T的细胞脂肪酸组成与Rhizobium最为接近,但与Rhizobium内已知种的细胞脂肪酸组成存在明显差异,如不含18:0和20:3 6,9,12c,含有相对较高含量的17:0 iso 3-OH,含有18:0 3-OH。这都说明了以CCNWSX 0483T为代表的拟定根瘤菌新种群是Rhizobium内的根瘤菌新种。另外,不能利用PCR技术从该新种中扩增出结瘤基因nodA和固氮基因nifH,以及致病基因virC;该拟定根瘤菌新种群不能与植物形成根瘤,不能导致植物疾病。由此可知,该拟定根瘤菌新种群不具共生基因和致病基因,不具植物结瘤和致病特性。基于以上研究结果,我们认为本实验所研究的根瘤菌群为根瘤菌新种,建议将其命名为Rhizobium taibaishanense,并将CCNWSX 0483T（=ACCC 14971T =HAMBI 3214T）作为该新种的模式菌株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 根瘤菌分类现状
• 1.3 根瘤菌属研究进展
• 1.4 根瘤菌多相分类研究技术
• 1.4.1 根瘤菌表型研究方法
• 1.4.2 根瘤菌遗传型分析方法
• 1.5 根瘤菌新种群的描述方法
• 1.6 研究目的及意义
• 1.6.1 鸡眼草属概述
• 1.6.2 鸡眼草属根瘤菌研究进展
• 1.6.3 西北地区鸡眼草属根瘤菌的研究意义
• 第二章 16S rDNA 基因全序列及持家基因分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 DNA 模板的制备
• 2.1.3 16S rDNA、recA 和glnA 基因序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 16S rDNA 基因序列及其系统发育分析
• 2.2.2 recA 基因序列及其系统发育分析
• 2.2.3 glnA 基因序列及其系统发育分析
• 2.3 讨论
• 第三章 rep-PCR 指纹图谱和DNA 同源性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 rep-PCR 指纹图谱分析
• 3.1.3 DNA 同源性分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 rep-PCR 指纹图谱分析
• 3.2.2 DNA 同源性分析
• 3.3 讨论
• 第四章 共生结瘤特性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 结瘤基因（nodA） 和固氮基因（nifH） 的PCR 扩增
• 4.1.3 回接结瘤实验
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 结瘤基因（nodA） 和固氮基因（nifH） 的PCR 扩增
• 4.2.2 回接结瘤实验
• 4.3 讨论
• 第五章 表型性状研究
• 5.1 供试菌株
• 5.2 生理生化性状测定及聚类分析
• 5.2.1 性状测定
• 5.2.2 聚类分析
• 5.3 全细胞脂肪酸组成分析（FAME）
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 生理生化性状测定
• 5.4.2 数值分类
• 5.4.3 全细胞脂肪酸组成分析
• 5.5 讨论
• 第六章 植物致病性分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 供试菌株
• 6.1.2 致病基因（virC） 的扩增
• 6.1.3 植物致病性检测
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 致病基因（virC） 的扩增
• 6.2.2 植物致病性检测
• 6.3 讨论
• 第七章 结论
• 7.1 多相分类研究结论
• 7.2 新种Rhizobium taibaishanense 的描述
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介