论文题目: 苦瓜降糖多肽-P的分离纯化及降糖机理研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 粮食,油脂与植物蛋白工程
作者: 盛清凯
导师: 姚惠源
关键词: 苦瓜多肽,氨基酸序列,型糖尿病,并发症,胰岛素抵抗,生物信息学,蛋白激酶
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 苦瓜(Momordica charantia)为葫芦科苦瓜属一年生草本植物,分布于东非、亚洲、南美等世界各地,我国各地都有种植。长久以来,人们用苦瓜粉、苦瓜汁、苦瓜有机提取物治疗糖尿病,并对其中的功能成分进行了长期探索。目前大量实验表明,苦瓜中存在多肽类和苷类等多种降糖活性成分。本文确定以俗称“苦瓜植物胰岛素”的苦瓜降糖多肽-P ( P-polypeptide )为研究目标,对其分离纯化方法、2型糖尿病降糖机理、糖尿病并发症改善、物理性质、结构和构效关系进行了系统研究。确定苦瓜降糖多肽-P为研究目标。用超滤方法对苦瓜中的降糖肽进行初步筛选。用分子质量为10kD、3kD和1kD超滤膜对苦瓜汁进行三级超滤,对其超滤和截留组分进行糖尿病动物实验。结果表明,3kD和1kD间的截留组分口服,可降低正常和四氧嘧啶糖尿病模型鼠的血糖,其它组分口服无降糖效果。通过对苦瓜汁组分分析,表明苦瓜中含有苦瓜多肽-P。用凝胶柱层析和反相高效液相色谱方法分离纯化苦瓜多肽-P。采用动物降糖实验、薄层层析、电泳及氨基酸组成分析方法鉴定,用凝胶柱层析和反相高效液相色谱方法分离纯化苦瓜多肽-P。用Edman降解方法首次对苦瓜多肽-P进行了氨基酸序列测定,结果表明苦瓜多肽-P为由166个氨基酸残基组成的多肽。凝胶柱层析和反相高效液相色谱方法便于大量制备,优于过去的薄层层析制备方法。对苦瓜多肽-P的降糖功能进行了研究。腹腔注射大鼠链脲霉素与饲喂高脂日粮结合,建立肥胖型2型糖尿病动物模型。皮下注射苦瓜多肽-P,可降低2型糖尿病肥胖模型大鼠的血糖,改善葡萄糖耐量,降低血清胰岛素的浓度,升高肝脏和肌肉中糖原的含量。苦瓜多肽-P还可降低糖尿病模型大鼠的胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平,升高高密度脂蛋白的含量,调节血脂异常代谢。苦瓜多肽-P还可降低2型糖尿病模型大鼠血清和肝脏的过氧化氢、丙二醛浓度,增强血清和肝脏超氧化物酶活力,提高机体总抗氧化能力,改善糖尿病并发症。苦瓜多肽-P降糖机理在于提高组织对胰岛素的敏感性,改善胰岛素抵抗。采用生物信息学方法首次对苦瓜多肽-P进行序列分析和结构预测。结果表明,苦瓜多肽-P的分子质量为17702.7D,分子式为C763H1233N217O256S5。苦瓜多肽-P为酸性多肽,理论等电点4.86,非球形结构,可被多种酶水解。采用BLASTp同源比较,结果表明苦瓜多肽-P的氨基酸序列与数据库中蛋白质或多肽序列相似性小于30%,与动物胰岛素无同源性。采用PDH、NNPREDICT、GOR三个服务器进行二级结构预测,结果表明苦瓜多肽-P二级结构至少含有3个β折叠和1个α螺旋,其中其氨基酸序列28-31(-Cys-Leu-Tyr-Glu-)区域、86-88(-Glu-Cys-Ile-)区域、104-106(-Leu-Ile-Val-)区域为β折叠、127-133(-Lys-His-Ala-Ser-Glu-Val-Lys-)为α螺旋。28-31
论文目录:
摘要
Abstract
缩略表
第一章绪论
1.1 苦瓜的营养价值
1.2 苦瓜的药用价值
1.3 苦瓜的生物活性研究进展
1.3.1 降低血糖作用
1.3.1.1 苦瓜制剂的降糖作用
1.3.1.2 苦瓜复方制剂的降血糖作用
1.3.2 抗病毒及肿瘤活性
1.3.3 抗生育作用
1.3.4 杭菌作用
1.3.5 毒性
1.4 苦瓜降糖作用的国内外研究进展
1.4.1 苦瓜降糖成分的研究进展
1.4.1.1 多肽类化合物的降血糖活性
1.4.1.2 苷类化合物的降糖活性
1.4.1.3 苦瓜中不同降血糖成分之间的相互作用
1.4.2 苦瓜降血糖机理的研究进展
1.4.2.1 对胰脏及β细胞的保护作用
1.4.2.2 促进胰岛素的分泌
1.4.2.3 胰岛外效应
1.4.3 苦瓜降糖作用进一步研究的问题
1.5 立题背景和意义
1.6 主要研究内容
参考文献
第二章 苦瓜降糖肽的筛选
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料与设备
2.1.1.1 实验材料
2.1.1.2 实验设备
2.1.2 实验方法
2.1.2.1 苦瓜降糖肽的超滤工艺
2.1.2.2 苦瓜汁超滤工艺条件
2.1.2.3 营养成分测定方法
2.1.2.4 超滤工艺指标
2.1.2.5 降糖活性测定
2.1.2.6 数据分析
2.2 结果与讨论
2.2.1 苦瓜营养成分分析
2.2.2 苦瓜多糖及多肽标准曲线
2.2.3 10kD 膜超滤工艺优化
2.2.3.1 超滤条件的优化
2.2.3.2 膜通量和超滤时间的关系
2.2.3.3 10kD 膜截留率与料液浓缩倍数关系
2.2.3.4 超滤时间与料液温度变化关系
2.2.4 3kD 膜超滤
2.2.4.1 3kD 膜超滤压力对膜通量的影响
2.2.4.2 3kD 膜通量与超滤时间的关系
2.2.4.3 3kD 膜截流滤与料液浓缩倍数的关系
2.2.5 1kD 膜超滤
2.2.5.1 1kD 膜超滤压力对膜通量的影响
2.2.5.2 1kD 膜通量与超滤时间的关系
2.2.5.3 1kD 膜截流滤与料液浓缩倍数的关系
2.2.6 苦瓜超滤组分降糖效果
2.2.6.1 苦瓜超滤组分汁对正常小鼠血糖的影响
2.2.6.2 苦瓜超滤组分对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响
2.2.7 苦瓜汁组分分析
2.2.8 膜的清洗
2.3 本章小结
参考文献
第三章 苦瓜多肽-P的分离纯化及序列测定
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料与设备
3.1.1.1 实验材料
3.1.1.2 主要设备
3.1.2 实验方法
3.1.2.1 苦瓜多肽提取
3.1.2.2 苦瓜多肽紫外扫描
3.1.2.3 SDS-PAGE 凝胶电泳
3.1.2.4 皂苷显色反应
3.1.2.5 薄层层析
3.1.2.6 成分测定方法
3.1.2.7 降糖活性测定
3.1.2.8 氨基酸序列测定
3.1.2.9 数据处理
3.2 结果与讨论
3.2.1 凝胶层析分离
3.2.1.1 凝胶分离
3.2.1.2 苦瓜多肽 P1、P2 对小鼠血糖的影响
3.2.1.3 P2 组分分析
3.2.2 反相高效液相色谱纯化
3.2.2.1 上样量选择
3.2.2.2 梯度洗脱条件选择
3.2.3 苦瓜多肽PA 的鉴定
3.2.3.1 薄层层析
3.2.3.2 SDS-PAGE 凝胶电泳
3.2.3.3 氨基酸组成分析
3.2.4 苦瓜降糖多肽-P 的氨基酸序列
3.3 本章小结
参考文献
第四章 苦瓜多肽-P 的降糖效果与机理研究
4.1 材料与方法
4.1.1 实验材料与设备
4.1.1.1 实验材料
4.1.1.2 主要设备
4.1.2 实验方法
4.1.2.1 高脂实验日粮配制
4.1.2.2 动物分组
4.1.2.3 糖耐量测定
4.1.2.4 血清胰岛素浓度及胰岛素敏感指数测定
4.1.2.5 肝糖原/肌糖原含量测定
4.1.2.6 血脂指标的测定
4.1.2.7 体重及采食量测定
4.1.2.8 数据处理
4.2 结果与讨论
4.2.1 2 型肥胖型糖尿病动物模型的建立
4.2.2 苦瓜多肽-P 对空腹血糖和葡萄糖耐量的影响
4.2.3 苦瓜多肽-P 对胰岛素抵抗的影响
4.2.3.1 苦瓜多肽-P 对血清胰岛素的影响
4.2.3.2 苦瓜多肽-P 对胰岛素抵抗的影响
4.2.3.3 苦瓜多肽-P 对肝脏、肌肉组织糖代谢的影响
4.2.4 苦瓜多肽-P 对大鼠采食量及体重的影响
4.2.5 苦瓜多肽-P 对大鼠血脂代谢的影响
4.2.6 苦瓜多肽-P 与苦瓜降糖效果比较
4.3 本章小结
参考文献
第五章 苦瓜多肽-P 对糖尿病并发症的防治
5.1 实验材料与方法
5.1.1 实验材料与设备
5.1.1.1 实验材料
5.1.1.2 实验设备
5.1.2 实验方法
5.1.2.1 肝组织匀浆液制备
5.1.2.2 总抗氧化能力测定
5.1.2.3 超氧化物酶(SOD)测定
5.1.2.4 过氧化氢(H202)含量测定
5.1.2.5 丙二醛(MDA)含量测定
5.1.2.6 组织中总蛋白含量的测定
5.1.2.7 数据处理
5.2 结果与讨论
5.2.1 苦瓜多肽-P 对糖尿病大鼠总抗氧化能力的影响
5.2.2 苦瓜多肽-P 对糖尿病大鼠自由基的影响
5.2.3 苦瓜多肽-P 对糖尿病大鼠 SOD 活力的影响
5.2.4 苦瓜多肽-P 防治糖尿病并发症的机理探讨
5.3 本章小结
参考文献
第六章 苦瓜多肽-P 的结构预测及构效关系研究
6.1 材料与方法
6.1.1 实验材料与设备
6.1.1.1 实验材料
6.1.1.2 实验设备
6.1.2 实验方法
6.1.2.1 苦瓜多肽-P氨基酸序列理论分析
6.1.2.2 苦瓜多肽-P样品制备
6.1.2.3 苦瓜多肽-P对小鼠血糖的影响
6.1.2.4 数据处理
6.2 结果与讨论
6.2.1 分子量、分子式及等电点计算
6.2.2 同源性比较
6.2.3 苦瓜多肽-P 结构预测
6.2.3.1 苦瓜多肽-P 二级结构预测
6.2.3.2 苦瓜多肽-P疏水性结构分析
6.2.3.3 苦瓜多肽-P 三级结构预测
6.2.3.4 苦瓜多肽-P球形结构预测
6.2.3.5 跨膜结构分析
6.2.4 苦瓜多肽-P 的酶解肽段研究
6.2.4.1 苦瓜多肽-P 酶切位点预测
6.2.4.2 苦瓜多肽-P 酶解后对小鼠血糖的影响
6.2.5 苦瓜多肽-P保守序列肽段研究
6.2.5.1 模体搜索苦瓜多肽-P 的保守序列肽段
6.2.5.2 苦瓜多肽-P 通过 PKC 发挥降糖作用
6.2.5.3 苦瓜多肽-P 通过 PKA 发挥降糖作用
6.2.5.4 苦瓜多肽-P 减缓糖尿病并发症的机理探讨
6.3 本章小结
参考文献
主要结论
论文创新点
攻读博士学位期间发表论文情况
致谢
附录
发布时间: 2006-07-20
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