Flt-1在小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层中的作用及机制研究

论文摘要

目的脑部肿瘤严重危害人类的健康,以继发性脑瘤为主。肺癌为癌症的首要杀手,小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）为临床常见的恶性肿瘤,生长快,侵袭力强,易发生胸内或远端转移,近一半的SCLC患者会发生脑转移,SCLC发生脑转移是导致这类疾病死亡的主要原因。脑转移的关键步骤是小细胞肺癌从血液中游离出跨血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）进入脑组织。血脑屏障是位于脑组织与血液之间的一个复杂细胞系统,血脑屏障的物质基础是脑部的微血管,脑微血管内皮细胞间的紧密连接（tight junction,TJ）使得血管内皮细胞间相互“焊接”得十分紧密,不象其他组织微血管壁那样有较大的缝隙,对于保护脑组织周围稳定的生理环境和防止血液中有害物质侵入脑内具有重要的生理意义。紧密连接由许多蛋白构成,完整的紧密连接结构蛋白主要由跨膜蛋白、胞质附着蛋白和细胞骨架（微丝）三种组分构成。跨膜蛋白如occludin、claudins和连接粘附分子（junctional adhesive molecule,JAM）等,为跨膜糖蛋白,参与封锁相邻细胞间的空隙;胞质附着蛋白如ZO-1、ZO-2和ZO-3等,ZO为紧密连接处的膜外周蛋白,将occludin与其下面的actin骨架相连。这些蛋白附着到细胞骨架上,彼此相互作用,参与维持和调节紧密连接的屏障功能。多种机制参与调节细胞间TJ的功能,occludin蛋白的高度磷酸化在TJ结构的组装和功能的调节上起到重要的作用。膜周边蛋白ZO-1将跨膜蛋白occludin和actin骨架纤维相连,actin既是细胞间TJ结构组分,又是TJ渗透性的调节者。一些调控actin骨架纤维组装的信号分子也与TJ渗透性功能的调节相关。小GTP结合蛋白RhoA为公认的actin骨架纤维的调节者,我们实验室最近的研究表明:小细胞肺癌细胞（NCI-H209细胞）能够通过内皮细胞的Rho/ROCK信号通路指导其跨过人脑微血管内皮细胞（HBMEC）单层迁移,但有关其穿过HBMEC单层的详细机制尚未清楚。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）又称为血管渗透因子,其蛋白家族包括VEGF-A,B,C,D和胎盘生长因子（Placental growthfactor,PlGF）。PlGF为分泌的糖蛋白,与VEGF在氨基酸序列残基上有53%的同源性,且其生物学功能与VEGF也有相似之处,如刺激内皮细胞生长等。血管内皮生长因子受体1（Vascular endothelial growth factor receper,VEGFR-1,又称为Fms-1ike tyrosine kinase-1,Flt-1）,为PlGF在细胞膜上的专一受体,属于受体酪氨酸激酶家族成员,由七个免疫球蛋白样结构的胞外区、跨膜区、近膜区、激酶插入区和C-末端构成。PlGF与Flt-1的胞外区结合后,可活化受体的酪氨酸激酶,活化的酪氨酸激酶在信号转导的传递和生物学功能的发挥中起到重要的作用。本实验室通过免疫组化技术检测到小细胞肺癌细胞高表达PlGF,并证实PlGF在小细胞肺癌细胞跨人脑微血管内皮细胞单层迁移过程中发挥作用,但有关PlGF的受体Flt-1在这一过程中所发挥的作用及机制尚不清楚,本研究试图回答该问题。方法一、探讨Flt-1受体在小细胞肺癌细胞跨人脑微血管内皮细胞单层迁移中的作用1、细胞培养（1）HBMEC细胞培养于含10%胎牛血清和10%Nu血清的RPMI1640培养液（2）NCI-H209细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养液2、免疫荧光技术观察NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养后内皮细胞间TJ结构改变3、蛋白抽提和Western blot方法分析NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养后TJ蛋白occludin的可溶性片段和不可溶性片段的分布情况4、跨内皮迁移实验分析NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养后其跨HBMEC单层迁移能力5、HRP flux检测分析NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养后HBMEC单层渗透性改变6、Western blot方法检测NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养后Flt-1蛋白表达情况7、中和抗体及抑制剂封闭实验利用Flt-1中和抗体和VEGFR-1、2受体抑制剂,分析Flt-1受体及其磷酸化形式在NCI-H209细胞的跨内皮单层迁移中的作用8、建立和培养稳定干扰Flt-1的HBMECs并检测其与NCI-H209细胞共培养后相关生物学特性的变化二、探讨Rho/ROCK信号通路通过Flt-1受体启动小细胞肺癌细胞跨人脑微血管内皮单层迁移中的作用1、细胞培养2、免疫荧光技术细胞骨架蛋白的形态观察3、中和抗体实验利用Flt-1中和抗体能够封闭Flt-1受体结合区的特性,观察受体封闭后,NCI-H209细胞致HBMEC单层细胞骨架形态变化的改变4、Rho活性检测利用Flt-1中和抗体和稳定干扰Flt-1沉默的HBMECs,检测经NCI-H209细胞作用后,HBMEC单层细胞内活化形式的GTP-RhoA表达情况;利用不同浓度的PlGF纯品,检测其对HBMEC单层细胞内活化形式的GTP-RhoA表达情况的影响5、Western blot方法利用稳定干扰Flt-1的HBMECs,检测NCI-H209细胞与其单层共培养后,内皮细胞内的p-cofilin和cofilin的表达情况;利用PlGF纯品,检测HBMEC单层在PlGF作用下内皮细胞内的p-cofilin和cofilin的表达情况6、蛋白抽提和Western blot方法分析PlGF纯品对TJ结构蛋白occludin可溶性片段和不可溶性片段分布的影响7、跨内皮迁移实验和HRP flux检测利用高表达ROCK的HBMECs（ROCK-WT）、Rho结合突变的HBMEs（ROCK-KDIA）和ROCK特异性抑制剂（Y27632）,分析内皮细胞内的Rho/ROCK信号通路在NCI-H209细胞的跨内皮单层迁移及致内皮单层渗透性改变中的作用三、探讨Sre分子在参与Flt-1受体介导的小细胞肺癌细胞跨人脑微血管内皮细胞单层迁移过程中的作用1、细胞培养2、Western blot方法检测NCI-H209细胞及PlGF纯品作用后的HBMEC单层细胞内的p-Src和c-Src的表达情况;利用稳定干扰Flt-1的HBMECs,检测其与NCI-H209细胞共培养后内皮细胞内的p-Src和c-Src的表达情况;利用Src分子的特异性抑制剂（pp1）,分析NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养后内皮细胞内的p-cofilin和cofilin表达情况3、免疫共沉淀检测Flt-1受体与c-Src分子间的相互作用4、Rho活性检测利用src活性缺失突变的HBMECs（Src-DN）,检测经NCI-H209细胞作用后的内皮细胞单层细胞内活化形式的GTP-RhoA表达情况;利用不同浓度的PlGF纯品,检测其对HBMEC单层细胞内活化形式的GTP-RhoA表达情况的影响5、跨内皮迁移实验和HRP flux检测利用Src分子的特异性抑制剂（PP1）,分析抑制Src分子的活性对NCI-H209细胞跨内皮单层迁移能力及致HBMEC单层渗透性改变的影响结果一、Flt-1受体与小细胞肺癌细胞穿人脑微血管内皮细胞单层有关1、NCI-H209细胞能够穿过人脑微血管内皮细胞单层,并引起内皮单层细胞间紧密连接“开放”（1）NCI-H209细胞能够穿过HBMEC单层（2）HRP flux实验分析显示:NCI-H209细胞能够引起HBMEC单层渗透性增高（3）NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养,能够引起内皮细胞间TJ结构改变（4）Occludin蛋白抽提实验显示:NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养能够引起TJ构成蛋白occludin片段分布改变2、Flt-1受体参与NCI-H209细胞跨人脑微血管内皮细胞单层迁移（1）NCI-H209细胞与HBMEC共培养,Flt-1表达略有升高（2）Flt-I磷酸化激酶抑制剂能够降低NCI-H209细胞跨HBMEC单层迁移（3）Flt-1中和抗体能够降低NCI-H209细胞跨HBMEC单层迁移（4）Flt-1中和抗体能够消除NCI-H209细胞引起的HBMEC单层TJ结构的改变3、干扰Flt-1的HBMECs能够下调NCI-H209细胞的跨内皮迁移及消除NCI-H209细胞引起的内皮细胞间TJ的改变（1）成功建立稳定干扰Flt-1的HBMECs（2）干扰Flt-1的HBMECs能够下调NCI-H209细胞的跨内皮迁移（3）干扰Flt-1的HBMECs能够消除NCI-H209细胞引起的内皮细胞间TJ的“开放”二、Flt-1通过Rho/ROCK信号通路启动小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮单层1、Flt-1受体阻断能够消除NCI-H209细胞引起的HBMEC单层细胞内actin骨架纤维的改变（1）NCI-H209细胞能够引起HBMEC单层细胞内actin骨架纤维发生变化（2）Flt-1受体阻断及干扰沉默能够消除NCI-H209细胞引起的HBMEC单层细胞actin骨架纤维的变化2、Flt-1受体参与NCI-H209细胞引起的HBMEC单层细胞内的Rho/ROCK信号通路的活化及引起的骨架纤维的重排（1）Flt-1中和抗体和干扰Flt-1的HBMECs均能够消除NCI-H209细胞引起的Rho/ROCK信号途径的活化（2）干扰Flt-1的HBMECs能消除NCI-H209细胞引起的内皮细胞骨架相关蛋白cofilin磷酸化水平增高3、PlGF纯品能够活化HBMEC单层细胞内的Rho/ROCK信号通路,并引起TJ相关蛋白分布改变（1）PlGF能够活化HBMEC单层细胞内的RhoA蛋白,具有浓度依赖性（2）PlGF能够引起HBNEC单层细胞内骨架相关蛋白cofilin磷酸化水平增高,具有浓度依赖性（3）PlGF能够引起HBMEC单层TJ相关蛋白Occludin片段分布改变4、抑制或活化Rho/ROCK信号通路可下调或增加NCI-H209细胞的跨内皮迁移（1）ROCK抑制剂Y27632可降低NCI-H209细胞跨HBMEC单层迁移（2）过表达ROCK及Rho结合突变的（ROCK DN）的HBMECs分别能够增强和下调NCI-H209细胞跨HBMEC单层迁移三、Src参与Flt-1介导的小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层1、抑制Src信号通路能够下调NCI-H209细胞的跨内皮单层迁移（1）Src抑制剂PP1可下调NCI-H209细胞跨HBMEC单层的迁移（2）Src活性缺失突变的HBMECs（Src-DN）能够降低NCI-H209细胞的跨内皮单层的迁移（3）Src抑制剂PP1能够降低PlGF引起的内皮单层渗透性的增加2、NCI-H209细胞及PlGF均能够活化HBMEC内的Src分子（1）NCI-H209细胞能够引起HBMEC单层细胞内的Src信号分子的磷酸化水平表达增高（2）PlGF能够引起HBMEC单层细胞内的Src信号分子的磷酸化水平表达增高3、Flt-1受体与Src信号分子相互作用,参与NCI-H209跨内皮迁移过程中Src信号分子的活化（1）干扰Flt-1的HBMECs能够消除NCI-H209细胞引起的Src分子的活化（2）Flt-1磷酸化激酶抑制剂能够消除NCI-H209细胞引起的Src分子的活化（3）Flt-1受体能够与HBMEC内的Src信号分子结合,形成复合物4、Src分子与RhoA分子相关,共同调节RhoA下游效应蛋白cofilin的活性（1）Src活性缺失突变的HBMECs（Src-DN）能够消除NCI-H209细胞引起的RhoA蛋白的活化（2）Src信号分子抑制剂PP1能够消除NCI-H209细胞引起的Rho/ROCK下游效应蛋白cofilin磷酸化结论1、小细胞肺癌细胞通过Flt-1受体开通人脑微血管内皮细胞单层细胞间的紧密连接,引起内皮细胞单层渗透性增加,实现其跨内皮迁移。2、NCI-H209细胞在跨内皮单层迁移过程中,通过Flt-1受体活化内皮细胞Rho/ROCK信号,调节actin骨架纤维重排和TJ完整性,使其穿过内皮细胞单层。3、Src分子及其磷酸化形式参与了Flt-1受体介导的NCI-H209细胞穿人脑微血管内皮细胞单层。Src与RhoA在Flt-1受体介导NCI-H209细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层中的相互关系有待进一步研究。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一、Flt-1与小细胞肺癌细胞穿人脑微血管内皮细胞单层有关
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文二、Flt-1通过 Rho/ROCK 信号通路启动小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮单层
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文三、Src 参与 Flt-1介导的小细胞肺癌穿过人脑微血管内皮细胞单层
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 致谢
• 个人简介