禾谷镰刀菌致病相关基因的鉴定及其毒素DON特异亲和肽段的淘选

论文摘要

由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的赤霉病(（Fusarium Head Blight）是世界性流行病害,危害小麦、大麦、玉米的生产。该病害的流行不仅造成作物的严重减产、品质降低,而且导致受侵染籽粒中含有真菌毒素,危害食品安全和人畜健康。禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是单端孢霉烯族化合物中的一种,主要污染小麦、玉米等谷物及其制品。DON毒素对的谷物污染严重,在收割季节如雨量偏多则DON的污染更为严重。DON毒素不仅具有生殖毒性、免疫毒性和致动物呕吐等急性毒性,而且与人的癌症的诱发相关。本研究围绕禾谷镰刀菌展开,共分两部分,第一部分旨在鉴定同禾谷镰刀菌致病性相关的基因,进一步探明禾谷镰刀菌的致病机制；第二部分旨在通过淘选同毒禾谷镰刀菌素DON特异亲和的肽段,达到简化DON毒素检测方法的目的。本研究以突变体库中经初次鉴定为致病力变异菌株的10个突变体菌株和野生型菌株为材料,围绕致病相关基因的鉴定,首先通过人工接种方法在抗赤性不同的小麦品种中淘选出具有显著致病力变异的突变体菌株,进而利用绿色荧光蛋白标记比较致病力变异菌株同野生型菌株在致病进程上的差异,观察突变基因对菌株致病力的影响方式,最后利用TAIL-PCR技术鉴定出菌株中发生插入突变的基因。结果表明,突变菌株G12在三个小麦品种中的致病力明显增强,且同初次鉴定结果相符。通过绿色荧光蛋白标记观察致病进程表明,突变体G12对穗轴的侵染更早,在穗轴中的荧光信号更强。TAIL-PCR对突变体插入位点侧翼序列进行扩增结果表明,突变体G12的转座子插入位点位于一个未知基因FGSG04134.3的编码区内,蛋白结构域分析表明该蛋白含有一个C2H2型锌指结构,同源性分析表明,该基因编码的氨基酸序列同烟曲霉和稻瘟病菌的con7p转录因子同源性达53%。推测突变基因可能是同禾谷镰刀菌致病性相关的转录因子,并以负调控的方式影响致病相关基因的表达。该基因的具体功能有待进一步研究。为了建立针对DON毒素的更加简便的检测方法,本研究在制备DON人工抗原的基础上,从噬菌体随机七肽库中淘选DON的特异亲合肽段,并通过竞争性ELISA对淘选到的肽段加以验证。人工抗原合成结果表明：采用丁基硼酸封闭法制备的DON人工抗原的适合噬菌体的淘选要求,TLC检测表明人工抗原合成成功；亲和肽段淘选结果表明：经过四轮淘选,噬菌体出现富集现象,ELISA检测阳性克隆并测序,结果表明,淘选到得阳性噬菌体氨基酸序列为MAPGWVP.竞争性ELISA检测表明,该肽段同DON毒素分子具有特异亲和性,结合率随竞争的线性区间在0.01-0.1μg/ml。表明以该短肽替代常规ELISA检测中的DON免疫抗体,可以用于检测浓度范围为0.01-0.1μg/ml的DON样品,这种方法绕过制备免疫抗体的过程,使DON毒素的免疫检测过程大大简化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 禾谷镰刀菌致病相关基因的鉴定
• 第一章 文献综述
• 1. 禾谷镰刀菌概况
• 1.1 禾谷镰刀菌与赤霉病
• 1.2 禾谷镰刀菌特征与类型
• 1.3 禾谷镰刀菌的致病机制
• 2. 禾谷镰刀菌基因组学主要研究方法及进展
• 2.1 禾谷镰刀菌的基因组学
• 2.2 禾谷镰刀菌功能基因组学
• 3. 禾谷镰刀菌突变体库的构建
• 4. 研究目的和意义
• 第二章 研究内容
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 禾谷镰刀菌突变体的致病力鉴定
• 2.2 TAIL-PCR方法克隆突变体转座子插入区侧翼序列
• 2.3 TAIL-PCR扩增结果的PCR验证
• 2.4 转座子所在片段的测序及分析
• 3. 讨论
• 3.1 致病力变异突变体菌株的鉴定
• 3.2 禾谷镰刀菌的侵染过程及影响因素
• 3.3 禾谷镰刀菌突变体库的构建及其插入位点的鉴定
• 3.4 转座子插入区域的基因功能预测
• 第二部分 DON特异亲和肽段的淘选
• 第一章 文献综述
• 1. 禾谷镰刀菌毒素
• 1.1 禾谷镰刀菌毒素与其致病力间的关系
• 1.2 脱氧雪腐镰刀烯醇（DON）的理化性质
• 2. 禾谷镰刀菌毒素DON的检测技术
• 2.1 薄层色谱法
• 2.2 气相色谱法
• 2.3 高效液相色谱
• 2.4 红外光谱分析
• 2.5 荧光极性免疫分析
• 2.6 酶联免疫吸附检测法
• 2.7 生物传感器检测法
• 3. 噬菌体表面展示技术及其在真菌毒素检测中的应用
• 3.1 噬菌体表面展示技术的原理与特点
• 3.2 噬菌体展示技术在真菌毒素检测中的应用
• 4. 研究目的和意义
• 第二章 研究内容
• 1. 实验试剂与仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 DON人工抗原（DON-HG-BSA）的合成
• 2.2 DON噬菌体特异亲和肽段的淘选
• 2.3 ELIAS方法淘选与人工抗原特异性结合的阳性噬菌体克隆
• 2.4 阳性噬菌体DNA模板的快速纯化、测序及多肽的共有序列分析
• 2.5 测序肽段的验证
• 3. 结果与分析
• 3.1 DON人工抗原（DON-HG-BSA）的合成
• 3.2 噬菌体肽库的生物淘选
• 3.3 阳性噬菌体克隆的ELISA鉴定
• 3.4 阳性噬菌体克隆的测序
• 3.5 测序肽段的亲和特异性验证
• 4. 讨论
• 4.1 噬菌体表面展示库及淘选策略
• 4.2 DON人工抗原的制备
• 4.3 DON亲和肽段的淘选
• 4.4 亲和肽段的验证
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文