FOXP3△2相互作用分子的筛选与鉴定

论文摘要

CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）是在机体整个免疫网络的负调节中发挥重要作用的一种CD4+T淋巴细胞亚群,在维持机体免疫自稳和防止自身免疫性疾病中发挥重要作用。叉状头转录因子Foxp3是诱导CD4+CD25+Tregs细胞发育及生物学功能发挥的主调控因子,具有下调免疫应答的功能。Foxp3基因突变或缺失会导致严重的自身免疫性疾病。鼠Foxp3突变导致Xsf/Y雄性杂合子小鼠发生进行性自身免疫缺陷病,表现为器官非特异性淋巴细胞浸润及多种细胞因子的大量分泌,从而导致Xsf/Y雄性杂合子小鼠多数在出生后16-25天内死亡。人类同源的Foxp3功能性突变可导致人类一种免疫调节紊乱的X连锁综合征（ immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome, IPEX）,表现为免疫失调、多种内分泌腺病、肠病、X染色体性联综合征。因此,Foxp3在免疫系统的负调节中发挥非常重要的作用。Foxp3的两个亚型（Foxp3FL和Foxp3△2 ）在人CD4+CD25+Tregs中均有表达,并且它们都具有赋予CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+Tregs的活性,但是目前关于Foxp3的作用机制尚未阐明。大量研究显示,Foxp3作为转录调控因子,并不直接调控下游靶基因,而是与其它一些转录因子或酶分子形成“动态超分子复合物”共同发挥转录调控功能。目前已知的Foxp3相互作用分子有NFAT、NF-кB、AML1/Runx1、AP-1、RORγt和TIP60,其中,在我们课题的进行中,陆续有文献报道Foxp3与AP-1、AML1/Runx1、RORγt和TIP60的相互作用。但是仅仅针对这些分子的研究并不能充分阐明Foxp3的转录调控机制,所以对未知的Foxp3相互作用分子的进一步探讨是Foxp3转录调控研究的热点。本课题是以Foxp3△2亚型作为诱饵,从外周血白细胞cDNA文库筛选可以与其相互作用的分子。最终我们获得40个阳性克隆,经DNA测序和Blast核苷酸相似性分析发现这40个阳性克隆所编码的蛋白质在Gal4 DNA激活域开放读框内的共9个。在这9个Foxp3△2候选相互作用分子中,我们重点对泛表达转录子（ubiquitously-expressed transcript,UXT）与Foxp3△2的相互作用进行研究。通过酵母双杂交回交验证和免疫共沉淀证实了Foxp3△2与UXT在酵母细胞和哺乳动物细胞内均存在相互作用,并且激光共聚焦扫描结果显示Foxp3△2和UXT共定位于细胞核,进一步为二者的相互作用提供了理论基础。为了明确Foxp3△2与UXT的作用部位,我们构建了Foxp3△2分子的5个截短体,并通过酵母双杂交中的β-半乳糖苷酶实验发现Foxp3△2的脯氨酸富含域对二者的相互作用是必不可少的。此外,我们对Foxp3和UXT相互作用的功能进行了初步的探讨。最近研究显示,Foxp3不但表达于淋巴细胞,还表达于多种肿瘤细胞,表达于肿瘤细胞的Foxp3可能参与了肿瘤的免疫逃逸。我们课题组已证实Foxp3在胃癌细胞系SGC-7901中的表达,现进一步探讨提高UXT的表达是否对Foxp3的表达有影响?结果显示提高胃癌细胞株SGC-7901中UXT的表达,Foxp3的表达量也相应增加,但是具体作用机制还需要深入的研究。综上所述,本课题通过酵母双杂交筛选共获得了9个与Foxp3△2相互作用的候选分子,并确认了Foxp3△2与UXT的物理相互作用及作用位点,为阐明Foxp3的转录调节机制奠定基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 FOXP3△2 与人外周血白细胞CDNA文库中相互作用分子的筛选
• 0 引言
• 1 主要实验材料和仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 实验二 FOXP3△2 与UXT候选结合蛋白相互作用的验证以及结合部位的确定
• 0 引言
• 1 主要实验材料和仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 实验三 FOXP3△2 与UXT相互作用功能的初步研究
• 0 引言
• 1 主要实验材料和仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢