论文摘要
在植物基因工程中,需要用到筛选标记以方便筛选转化子,随着转基因植物的商品化,其安全性问题也引起了人们的高度重视,其中主要涉及筛选标记的安全性。目前,植物基因工程中使用的筛选标记主要是编码抗生素抗性或除草剂抗性蛋白的基因,这些基因存在安全性方面的问题,为了提高转基因植物的安全性,人们开始寻找生物安全的筛选标记。本研究分别从拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum L.cv）中克隆得到甲硫氨酸合成过程中的关键酶基因胱硫醚-γ-合酶（cystathionine synthase,CGS1）基因和赖氨酸合成过程中的关键酶基因二氢吡啶二羧酸合酶（dihydrodipicolinatesynthase,DHDPS）基因,并对其进行体外分子改造,以解除末端产物对它们的反馈调节作用。研究将突变基因用做转基因植物的筛选标记,分别用甲硫氨酸类似物（乙硫氨酸,ETH）和赖氨酸类似物（S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸,AEC）作为筛选剂的可行性。由于氨基酸合成途径中的反馈调节作用,非转基因作物在氨基酸类似物的存在下会抑制相应氨基酸的合成而死亡,转基因植物由于不受氨基酸类似物的反馈调节作用,继续合成相应的氨基酸而得以存活下来。本研究试图为植物基因工程提供新型安全筛选标记基因。主要研究结果如下:1.CGS1、DHDPS基因的克隆从Genbank中查到CGS1、DHDPS基因序列,Genbank登录号分别为U43709和X79675。利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆得到CGS1基因,从烟草中克隆得到DHDPS基因。2.CGS1、DHDPS基因体外分子改造根据已有文献报道,通过对酶分子结构域的分析,确定突变方案,利用定点突变方法分别对CGS1、DHDPS进行体外分子改造。在拟突变位点设计PCR引物,分别向两个方向进行PCR扩增,再经过重叠延伸得到目的突变基因。共获得3个突变基因,其中CMI突变使得CGS成熟蛋白Gly84→Ser,CMⅡ突变使得CGS成熟蛋白Ser81→Asn,同时Gly84→Ser;DM使得DHDPS成熟蛋白Asn104→Ile。3.植物表达载体构建构建了CGS1、DHDPS基因及其突变基因的5个植物表达载体pBIC、pBICMⅠ、pBICMⅡ、pBID、pBIDM,目的基因受CaMV35S启动子的调控,载体上带有传统筛选标记基因nptⅡ,以便与本研究的新型筛选标记进行对比分析。4.农杆菌介导的遗传转化以烟草“龙江911”为受体材料,利用农杆菌介导法将上述构建的5个植物表达载体对烟草进行遗传转化。筛选培养基中添加除菌剂和筛选剂,其中筛选剂分两组添加,一组添加传统筛选剂Km:另一组添加氨基酸类似物（ETH或AEC）,通过Km和氨基酸类似物筛选,获得了一些抗性植株。5.抗性植株的检测PCR检测了转CGS1基因的Km抗性植株5株,其中4株呈阳性。PCR检测了转CMI基因的Km抗性植株5株,其中4株呈阳性。PCR检测了转CMI基因的ETH抗性植株3株,其中1株呈阳性。PCR检测了转DHDPS基因的Km抗性植株8株,其中6株呈阳性。PCR检测了转DM基因的Km抗性植株5株,其中2株呈阳性。PCR检测了转DM基因的AEC抗性植株2株,其中1株呈阳性。Real-Time PCR检测了转CGS1、CM、DHDPS、DM基因的Km抗性植株共计15株,检测了AEC筛选的转DM基因植株2株,外源基因均得到超量表达。6.新型筛选标记的可行性分析通过对烟草的遗传转化,用相应的类似物进行筛选,利用突变基因DM作为筛选标记筛选得到部分PCR阳性并超量表达外源基因的烟草苗。在分化阶段,用氨基酸类似物筛选烟草叶盘的分化率明显高于Km筛选,加之此类基因在增加转基因植物的营养价值方面的优越性,氨基酸代谢过程中的关键酶基因作为转基因植物筛选标记具有很大的应用前景,随着研究的深入,此类绿色筛选标记基因对植物代谢带来的负面影响均有望得到合理的解决。
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