枯草芽孢杆菌脂肽化合物合成调控基因功能研究及多功能生防工程菌株的构建

论文摘要

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有生长速度快,代谢产物丰富,利用开发价值高以及食用安全等显著优点,广泛应用于农业生物防治。研究枯草芽孢杆菌快速分子鉴定方法以获得更多具有应用价值的新菌株具有重要意义。采用16S rDNA序列分析法对本实验室采用传统方法鉴定的枯草芽孢杆菌菌株B3、38、43、49、55、85进行鉴定结果表明：测定的芽孢杆菌菌株与已报道的枯草芽孢杆菌属具有高度的同源性,其中B3、38、43、49、55、85菌株的16S rDNA与模式菌株168的同源性分别为99.4%、99.5%、99.7%、93.8%、96.8%和99.4%。B3的16S rDNA序列已经登录到了GenBank上,登录号为：EF492885。应用DNAstar软件对这些序列进行分析,构建了系统发育树,B3、38、43、49、55、85与枯草芽孢杆菌模式菌株168聚在一起,说明它们的亲缘关系较近。基质协助激光解吸附／电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）技术是近年来发展起来的新的质谱离子化技术,通过对细菌成分的分析,来鉴定细菌的类别。为快速准确鉴定枯草芽孢杆菌,本研究采用MALDI-TOF-MS对本实验室分离保存的枯草芽孢杆菌菌株B3、38、43、49、55、85进行分析,以来自美国菌种保藏中心菌株168,ATCC6633、 ATCC13952、ATCC21332,及柏林理工大学Dr.Joahim Vater惠赠的菌株A1/3、b213、C1为标准菌株。分析结果表明,枯草芽孢杆菌菌株一般出现3-4条谱带,其中m/z为379、493、618、714、843和969是经常和比较稳定出现的特征性信号谱带。我们对上述鉴定的枯草芽孢杆菌进行了油菜菌核病菌和水稻白叶枯病菌的平板抑菌实验。结果表明,菌株B3、38、43、49、55和85对油菜菌核病菌具有显著的抑制菌丝生长的作用,MALDI-TOF检测表明,这些菌株能够产生抑制真菌的脂肽化合物fengycin和iturin family（Bacillomycins D、Iturin和Mycosubtilins）.而38、43、55和85还对水稻白叶枯病菌具有显著抑制作用,可以用这些菌株能够产生具有抑制细菌活性的脂肽化合物surfactin来解释。为了提高枯草芽孢杆菌脂肽活性物质的产量,对脂肽化合物合成调控区的两个未知功能的基因ycxD和aspB3进行了初步的研究。枯草芽孢杆菌存在十多种GntR家族转录调控子,参与细菌中各种不同的生物过程的调控。基因功能预测表明,ycxD基因编码产物属于GntR家族转录调控子,并具有转氨酶的结构域。AspAT转氨酶编码基因也有十多个,这类酶对枯草芽孢杆菌氮和碳代谢起到非常重要的作用。基因功能预测表明,aspB3基因编码产物具有天冬氨酸转氨酶的功能域。为了验证这两个基因编码产物是否具有转氨酶的活性,本研究分别构建了大肠杆菌表达载体pETycxD和pETasp,并利用Ni柱纯化重组蛋白。转氨酶活性研究表明,YcxD蛋白不具有转氨酶的功能,推YcxD蛋白可能属于GntR转录调控因子家族,具体的功能有待进一步深入研究。酶活性检测表明,AspB3蛋白属于天冬氨酸转氨酶家族。对AspB3蛋白的酶学性质深入研究表明,AspB3转氨酶的最适反应温度为40℃,最适PH值为8.2,最适底物为L-Asp。该酶的热稳定性强,并且金属离子对酶反应有影响。AspB3蛋白的序列分析和系统发育研究表明AspB3转氨酶是新型的热稳定性天冬氨酸转氨酶,属于AspAT家族的I。亚家族。催化活性位点的研究表明：AspB3蛋白中D232残基的功能是固定辅酶,加强辅酶的吸电子能力和加速反应的活性；K270残基是辅酶PLP的结合部位；R403残基直接参与二羧基底物识别。目前,E.coli AspAT被应用于酶法生产氨基酸。例如,生成的L-苯丙氨酸（L-Phe）,但E.coli AspAT的热稳定性不强制约着这种酶法生产氨基酸的大规模应用。相比之下AspB3转氨酶具有热稳定性强、酶活性高,最适温度偏碱的优势,因此AspB3转氨酶具有应用生产L-Phe的价值。为了向枯草芽孢杆菌中引入新的生防作用因子,本研究利用芽孢杆菌分泌表达系统,构建了能分泌HpaGxooc蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌。HpaGxooc是由水稻细条斑菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）产生的一种非特异性蛋白激发子,属于harpin蛋白家族。HpaGxooc能激发非寄主植物的过敏性坏死,诱导植物抗虫、抗病和抗旱,而且能促进植物生长。在本研究中,为了利用芽孢杆菌表达系统分泌表达HpaGxooc构建了pMSF.pM43SF和pM43HF三个表达载体。pMSF重组载体含有Hpall组成性启动子和nprB信号肽组件；pM43SF和pM43HF两个重组载体都含有P43强启动子和nprB信号肽组件,不同的是为了快速地纯化分泌的重组蛋白,pM43HF分泌的HpaGxooc的C端融合了6×His tag标签。SDS-PAGE和Western blot实验结果表明芽孢杆菌能够分泌表达HpaGxooc蛋白。ELISA分析结果表明,B. subtilis WBSF1（pMSF）的HpaGxooc表达量低于B. subtilis WBSF2（pM43SF）和B. subtilis WBHF（pM43HF）,该实验证明了在芽孢杆菌中HpaⅡ启动子活性低于P43启动子。我们又将高效表达载体pM43HF转入surfactin生产菌株B. subtilis OKB105中,得到了基因工程菌株B. subtilis OKBHF。Western blot和ELISA检测表明B. subtilis OKBHF的HpaGxooc表达量低于WBHF。ELISA测定了B. subtilis WBHF分泌HpaGxooc的最佳培养条件。B. subtilis WBHF分泌的HpaGxooc的生物学功能的测定表明：该重组蛋白能激发烟草的HR（hypersensitive response）反应,和促进烟草根系的生长。RT-PCR分析表明HpaGxooc能诱导烟草防卫反应中病程相关基因PR-la and PR-1b的表达。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 枯草芽孢杆菌的快速鉴定及定量分析
• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 基于16S rRNA/DNA的枯草芽孢杆菌分子鉴定及定量分析
• 1.1 基因组DNA的获得
• 1.2 16SrRNA基因片段的获得
• 1.3 通过16S rRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定
• 2. MALDI-TOF-MS在细菌检测和鉴定中的应用
• 2.1 MALDI-TOF-MS的基本原理
• 2.2 分析的主要成分
• 参考文献
• 第二章 枯草芽孢杆菌遗传操作系统研究进展
• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 芽孢杆菌整合载体研究进展
• 1.1 同源序列重组整合
• 1.2 非常规重组整合
• 1.3 枯草芽孢杆菌整合载体的整合方式
• 1.4 芽孢杆菌整合载体的应用及前景
• 2. 枯草芽孢杆菌表达系统研究进展
• 2.1 启动子的结构及调控方式
• 2.2 枯草芽孢杆菌中的σ因子
• 3. 枯草芽孢杆菌感受态研究新进展
• 3.1 枯草芽孢杆菌自然转化的过程
• 3.2 枯草芽孢杆菌感受态的形成机制
• 3.3 晚期感受态蛋白的种类和功能
• 3.4 感受态信息素调节的意义
• 参考文献
• 第三章 生物活性非核糖体环肽合成机制的研究进展
• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 非核糖体大环肽类抗生素的结构特点
• 2. 非核糖体大环肽类抗生素的多样性
• 3. 非核糖体大环肽抗生素的生物活性
• 3.1 抗细菌作用
• 3.2 抗病毒的作用
• 4. 非核糖体肽合成酶的作用机理
• 4.1 模块的主要结构域
• 4.2 非核糖体合成肽的校正
• 4.3 非核糖体肽的脂质化机理
• 4.4 非核糖体肽中D-氨基酸的生成
• 5. 非核糖体合成酶硫脂结构域
• 5.1 肽链环化酶的结构以及催化机理
• 5.2 离体的TE结构域催化环化反应的研究
• 5.3 TE结构域的酶学特征
• 5.4 结合TE结构域的化学酶法途径合成新的环肽
• 6. 载体蛋白翻译后的修饰以及应用
• 7. “裁剪酶”介导的非核糖体肽的结构和功能多样性
• 7.1 非核糖体肽的甲基化
• 7.2 “裁剪酶”向NRPS中引入杂环元素
• 7.3 “裁剪酶”催化氧化交联形成刚性肽链骨架
• 7.4 “裁剪酶”催化NRPS卤化
• 8. 真核生物中的NRPS合成酶家族
• 9. 基因工程技术重组NRPS生产线
• 9.1 结构域或模块重组构建基因NRPSs菌株
• 9.2 定点突变策略构建基因NRPSs菌株
• 9.3 “突变合成”（mutasynthesis approach）构建基因工程NRPSs菌株
• 参考文献
• 下篇 研究内容
• 第一章 应用16S rDNA序列分析法和MALDI-TOF-MS技术快速准确鉴定枯草芽孢杆菌
• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 材料和方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 不同菌株16S rDNA的克隆和测序
• 2.2 不同菌株的16S rDNA序列分析
• 2.3 菌株B3、38、43、49、55、85的系统发育分析
• 2.4 枯草芽孢杆菌标准菌株在m/z为200～2000范围的信号谱带分析
• 2.5 供试菌株在m/z为200～2000范围的信号谱带分析
• 2.6 B3菌株在不同培养基产生的谱带
• 2.7 菌株的抑菌活性检测
• 2.8 菌株产生的脂肽化合物的MALDI-TOF-MS分析
• 3. 小结
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 枯草芽孢杆菌脂肽合成调控区ycxD和aspB3基因编码产物转氨酶活性的研究
• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 材料和方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 ycxD与asp基因大肠杆菌表达载体的构建
• 2.2 AspB3蛋白突变体的表达载体的构建
• 2.3 重组YCXD、AspB3蛋白以及AspB3蛋白突变体的纯化
• 2.4 AspB3和YcxD蛋白转氨酶活性的检测
• 2.5 AspB3转氨酶基本酶学性质的研究
• 2.6 AspB3蛋白系统发育分析
• 2.7 AspB3蛋白序列比对以及活性位点的分析
• 2.8 AspB3突变体酶活性的检测
• 2.9 AspB3蛋白空间结构的预测
• 3. 小结
• 讨论
• 参考文献
• Xooc蛋白体系的建立以及重组蛋白生物活性的检测'>第三章 枯草芽孢杆菌高效分泌表达HpaG_Xooc蛋白体系的建立以及重组蛋白生物活性的检测
• 摘要
• ABSTRACT
• Xooc蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达体系的建立'>第一节 HpaG_Xooc蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达体系的建立
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 小结
• Xooc分析'>第二节 枯草芽孢杆菌基因工程菌表达HpaG_Xooc分析
• 1. 材料和方法
• 2. 结果与分析
• 3. 小结
• 第三节 枯草芽孢杆菌表达的重组蛋白生物活性的分析
• 1. 材料和方法
• 2. 结果与分析
• 3. 小结
• 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文