猪瘟病毒强毒株与疫苗C株鉴别方法的建立及疫苗病毒定量检测的研究

论文摘要

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种高度接触性传染病。近年来,我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大的变化,在临床表现上趋于非典型化,主要表现为隐性带毒和慢性感染,成为影响养猪业发展的一大隐患。疫苗接种是预防控制猪瘟的重要手段,中国猪瘟兔化弱毒（Hog cholera lapinized virus, HCLV）疫苗是国际上公认的最安全有效的弱毒疫苗,对猪瘟的控制起到了重要作用。疫苗效价的高低是疫苗质量合格与否的关键指标,如何快速、准确测定疫苗病毒效价是猪瘟疫苗生产中亟待解决的主要难题之一。此外,猪瘟弱毒疫苗在中国的大规模应用使猪瘟野毒感染和疫苗接种的区分变得非常困难和必要,亟待建立一种可以准确诊断猪瘟野毒感染与疫苗接种的敏感、特异、重复性好的检测方法。为解决以上问题,本课题分三部分进行研究:1.成功建立了一种能够区分猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-nPCR）诊断方法。对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计一对通用引物,扩增片段为609 bp,并在该对引物扩增区域内设计针对弱毒的特异引物,扩增片段为237 bp。临床应用该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与其它猪源病毒发生非特异反应。应用本研究建立的RT-nPCR方法可以对猪瘟强毒做出快速准确诊断,可将野毒感染猪迅速从免疫猪群中筛选出来,可用于免疫猪群的猪瘟净化检测,并减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。2.成功建立了一种能够区分猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法。对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,设计一对共用下游引物以及分别针对猪瘟强毒与疫苗弱毒的特异性上游引物,预计Tm值分别为84.5±0.5℃和89.5±0.5℃,熔解曲线分析显示为单特异峰,并且具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点。本实验建立的鉴别猪瘟强毒感染与疫苗弱毒的荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法扩增效率高、线性范围广、检测时间短,可对猪瘟强毒感染做出快速准确诊断,可将强毒感染猪迅速从免疫猪群中筛选出来,可用于免疫猪群的猪瘟净化检测,并减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。3.成功建立了一种能够快速定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守的5’端非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒疫苗的特异性引物,扩增片段为245 bp,且不与牛病毒性腹泻病毒以及其它猪源病毒发生非特异性反应。应用本方法对16份猪瘟脾淋苗和细胞苗进行定量检测,结果表明102拷贝/μL的总RNA即能得到特异性扩增,在106～102拷贝/μL线性范围内有良好的扩增曲线,并与兔体定型热反应有良好的相关性。该法具有敏感、特异、重复性好等优点,可望取代传统的兔体反应热法用于猪瘟疫苗生产过程中的猪瘟病毒效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供一种新技术。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 猪瘟概况
• 1.2 猪瘟研究进展
• 1.2.1 猪瘟病毒
• 1.2.2 猪瘟病毒基因组结构
• 1.2.3 猪瘟病毒编码蛋白
• 1.2.4 猪瘟病毒的遗传分型
• 1.2.5 猪瘟的诊断方法
• 1.2.6 猪瘟疫苗
• 1.2.7 强毒与弱毒疫苗的鉴别诊断
• 1.2.8 结语
• 1.3 实时荧光定量PCR 研究进展
• 1.3.1 实时荧光定量PCR 的原理
• 1.3.2 实时荧光定量PCR 的分类
• 1.3.3 实时荧光定量PCR 的定量方法
• 1.3.4 实时荧光定量PCR 的应用
• 2 材料与方法
• 2.1 反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-NPCR）鉴别猪瘟强毒和疫苗弱毒诊断方法的建立
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 引物设计及合成
• 2.1.4 病毒
• 2.1.5 待检病料
• 2.1.6 溶液配制
• 2.1.7 实验仪器
• 2.1.8 病毒基因组总RNA 的提取
• 2.1.9 反转录cDNA 的合成
• 2.1.10 套式PCR 扩增反应
• 2.1.11 特异性实验
• 2.1.12 敏感性实验
• 2.1.13 重复性实验
• 2.1.14 临床应用
• 2.2 实时荧光定量RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的研究
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 引物设计及合成
• 2.2.4 病毒
• 2.2.5 待检病料
• 2.2.6 实验仪器
• 2.2.7 病毒RNA 的提取和反转录cDNA 的合成
• 2.2.8 常规PCR 扩增反应
• 2.2.9 荧光定量PCR 扩增反应
• 2.2.10 复合荧光定量PCR 反应
• 2.2.11 特异性实验
• 2.2.12 敏感性实验
• 2.2.13 重复性实验
• 2.2.14 与RT-nPCR 的比较
• 2.3 SYBR GREENΙ实时荧光定量 RT-PCR 检测猪瘟疫苗病毒含量的研究
• 2.3.1 菌株与质粒
• 2.3.2 试剂
• 2.3.3 引物设计及合成
• 2.3.4 疫苗
• 2.3.5 病毒
• 2.3.6 实验用兔
• 2.3.7 标准品的制备
• 2.3.8 实验仪器
• 2.3.9 病毒RNA 的提取和反转录cDNA 的合成
• 2.3.10 常规PCR 反应
• 2.3.11 荧光定量PCR
• 2.3.12 特异性实验
• 2.3.13 敏感性实验
• 2.3.14 重复性实验
• 2.3.15 标准品的制备
• 2.3.16 疫苗样品检测
• 2.3.17 荧光定量PCR 检测
• 2.3.18 兔体定型热反应法检测
• 3 结果与分析
• 3.1 反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-NPCR）鉴别猪瘟强毒和疫苗弱毒诊断方法的建立
• 3.1.1 RT-nPCR 检测方法的建立
• 3.1.2 重组质粒的PCR 鉴定及双酶切鉴定
• 3.1.3 复合RT-nPCR 的特异性
• 3.1.4 复合RT-nPCR 的敏感性
• 3.1.5 复合RT-nPCR 的重复性
• 3.1.6 临床应用
• 3.2 实时荧光定量RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的研究
• 3.2.1 荧光定量PCR 扩增结果
• 3.2.2 特异性实验
• 3.2.3 敏感性实验
• 3.2.4 重复性实验
• 3.2.5 与RT-nPCR 的比较
• 3.3 SYBR GREEN Ι实时荧光定量RT-PCR 检测猪瘟疫苗病毒含量的研究
• 3.3.1 常规PCR 扩增产物电泳结果
• 3.3.2 荧光定量PCR 扩增结果
• 3.3.3 特异性实验
• 3.3.4 敏感性实验
• 3.3.5 重复性实验
• 3.3.6 标准曲线的建立
• 3.3.7 疫苗样品的检测
• 4 讨论
• 4.1 反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-NPCR）鉴别猪瘟强毒和疫苗弱毒诊断方法的建立
• 4.2 实时荧光定量RT-PCR 反应结合熔解曲线分析鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的研究
• 4.3 SYBR GREEN Ι实时荧光定量RT-PCR 检测猪瘟疫苗病毒含量的研究
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 附录
• 8 致谢
• 9 论文发表情况