一种基于PHA合成调控蛋白PhaR的新型可定量检测蛋白质相互作用的大肠杆菌双杂交系统

论文摘要

聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控蛋白PhaR由两个不同的结构域组成:DNA结合域（DBD）和PHB颗粒结合域（GBD）。PhaR锚定在PHA颗粒结合蛋白PhaP的启动子区域,从而抑制PhaP的表达。聚羟基丁酸酯（PHB）是PHA最简单的一类,当PHB颗粒在体内积累时,PhaR与PHB颗粒结合促使PhaR从phaP启动子区域释放,进而催动phaP基因的表达。基于这个调控机制,我们开发了一种新型的细菌双杂交系统用于检测蛋白质间的相互作用,PhaR被分成两部分:DNA结合域DBD与诱饵蛋白融合,PHA颗粒结合域GBD与猎物蛋白融合,phaP被报告基因β-半乳糖苷酶基因lacZ代替。可能由于疏水性氨基酸的含量过高,GBD蛋白在体内表达后形成包涵体。所以,我们用同样与PHB颗粒有强结合能力的PhaP替代了GBD.为了研究该系统的可行性,我们选择了三组相互作用的模式蛋白bFos,bJun与bATF2。通过较高的β-半乳糖苷酶表达结果,显示bFos,bJun与bATF2之间可以两两相互作用,而且他们各自之间的相互作用均较强。相比之下,所有其他的缺少一个或多个本系统中必需元件的对照组,只检测到了很弱的β-半乳糖苷酶活性。这些结果明确地显示了该系统用于检测蛋白质之间相互作用的可行性。此外,bJun:bFos与bJun:bJun之间的相互作用要比bJun:bATF2强很多,这也通过β-半乳糖苷酶活性值的高低得到了验证,因此,该系统还可以定量检测蛋白质间相互作用的强弱。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 蛋白质—蛋白质的相互作用
• 1.1.1 蛋白质组学的研究背景和意义
• 1.1.2 蛋白质相互作用的研究方法
• 1.1.2.1 已经用于鉴定和表征蛋白质间相互作用的一些标准技术
• 1.1.2.2 鉴定和表征蛋白质间相互作用的生物物理学方法
• 1.1.2.3 最新研究进展
• 1.2 双杂交筛选系统简介
• 1.2.1 酵母双杂交体系
• 1.2.2 细菌双杂交体系
• 1.3 聚羟基脂肪酸酯（PHA）简介
• 1.4 PHA颗粒表面结合蛋白
• 1.4.1 PHA合酶（PhaC）
• 1.4.2 PHA颗粒结合蛋白（PhaP）
• 1.4.3 调控蛋白（PhaR）
• 1.4.4 PHA降解酶（PhaZ）
• 1.4.5 调控蛋白PhaR对PhaP合成的调控机制
• 1.4.6 PHA颗粒结合蛋白的研究现状及应用
• 1.5 转录因子AP-1 及Fos，Jun以及ATF2
• 1.6 本论文的目的和意义
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 实验所需引物
• 2.1.3 分子生物学常用的工具酶
• 2.1.4 常用试剂盒
• 2.1.5 常用生化试剂
• 2.1.6 聚合酶链式反应（PCR）用试剂
• 2.1.7 仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种保存方法
• 2.2.2 常用培养基的配制
• 2.2.3 常用溶液及缓冲液的配制
• 2.2.4 分子生物学常规操作
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.6 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.7 气相色谱法（GC）分析PHA单体组成与含量
• 2.2.8 胞内PHB颗粒合成及检测
• 2.2.9 β-半乳糖苷酶活性的测定
• 2.3 数据统计方法
• 第3章 基于PhaR的异源双杂交体系的研究
• 3.1 PhaR蛋白结构域的预测
• 3.2 模式诱饵蛋白和猎物蛋白的选择
• 3.3 试验所需质粒的构建
• 3.3.1 pFos-L-P质粒的构建流程如图3-2
• 3.3.2 pFos-L-P-CAB和pP-CAB质粒的构建流程如图3-3
• 3.3.3 pFos-L质粒的构建流程如图3-4
• 3.3.4 pDBD-L-Jun质粒的构建流程如图3-5
• 3.3.5 pOZ质粒的构建流程如图3-6
• 3.3.6 pDBD-L-Jun-Z 和pDBD-Z质粒的构建流程如图3-7
• 3.4 检测PHB颗粒的形成
• 3.5 各对照组设计及结果分析
• 3.6 结果讨论
• 第4章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果