论文摘要
病原体的快速检测和鉴定对于感染性疾病的诊断和治疗具有重要的意义。近年来由临床标本中分离的细菌以地区不同而有所不同,但普遍以肠杆菌,葡萄球菌,克雷伯菌,变形杆菌,沙雷菌,假单胞菌和气单胞菌等多见,由于大量广谱抗生素的不合理应用,引起正常菌群失调和耐药菌株的出现,平常对正常宿主不致病的常居菌引起内源性感染和治疗中插入性操作所导致的外源性感染也日益增多。在病原微生物的快速诊断方面,以分子生物学为基础的细菌鉴定方法主要以微生物的基因为检测靶标,既能够克服以微生物表型特征为基础检测方法的缺点和影响因素,从根本上对微生物进行鉴别和特征分型,同时能够大大缩短检测时间,提高检测灵敏度和特异性。纳米金是指直径为纳米范围的金颗粒或含金的化合物,它的化学性质稳定,可标记蛋白和核酸。同时,它具有与银反应后形成比原来体积大106倍的黑色颗粒,可以用肉眼观察或用普通记录装置如照相、扫描记录的特点,近年来受到了科研人员的重视,特别是用不具备吸附能力离散的纳米金作为信号报告分子的应用则是近年生物信号检测中的一个重要进展。本研究利用通用引物PCR将多个目标菌的待检基因片段百万倍的放大,与固定上特异性探针的基因芯片结合,再用巯基作为纳米金颗粒与核酸的连接分子,将纳米金标记在核酸上作为信号报告分子,旨在利用纳米金新型信号系统来达到小成本,高准确性的进行微生物学鉴定的目的。实验的主要方法及结果如下:1.选用了临床常见及一些强致病性的病原体为目标,完成了各靶病原体特征性核酸标志的确定,并针对16S rDNA 3’端及23S rDNA 5’端的最保守序列,设计了能够一次性扩增16个菌的通用引物。2.完成了16个病原体的PCR扩增方法,包括:金黄色葡萄球菌,溶血性葡萄球菌,腐生葡萄球菌,表皮葡萄球菌,肺炎链球菌,化脓性链球菌,无乳链球菌,铜绿假单胞菌,百日咳鲍特菌,淋病双球菌,肺炎克雷伯菌,枯草芽孢杆菌,洋葱假单胞菌,醋酸钙不动杆菌,奇异变形杆菌,洛菲氏不动杆菌,肠球菌,大肠埃希菌等,并对扩增条件进行优化,使各扩增反应能在相同的扩增条件下完成。3.在相同条件下设计了各靶病原体特异性寡核苷酸探针,利用生物信息学方法对探针进行计算机模拟筛选,对探针的特异性、可靠性的指标进行检测,并确定了杂交条件。结果显示各探针在G+C含量、发夹结构、自身二聚体以及重复碱基数等指标均符合寡核苷酸探针设计要求,所选用探针特异性强,具有相同的杂交条件。4.将筛选出的检测探针、阳性对照探针以及阴性探针点在尼龙膜上制成膜芯片,用生物素标记引物后对模板DNA进行扩增,杂交方法为反向斑点膜杂交,显色方法为DAB法和化学发光法,实验结果为相应检测探针点及阳性对照均有杂交结果,阴性对照、空白对照和其他探针点均无显影结果,背景清晰,结果可靠。证明本检测方法准确可靠,可用于各靶序列的检测。5.对反向斑点膜杂交的两种显色方法进行了比较研究,包括DAB显色法和化学发光显色法,证明前者操作简便,用时短,后者费时且步骤繁琐,但在灵敏度上远远优于前者。6.在前期实验的基础上,对最佳点样探针浓度的确立进行了研究,结果探针浓度从5nM到3000nM变化时,其显色强度先迅速增加,在浓度达到500nM后趋于平缓。与靶序列杂交后其杂交点信号强度值在高于1000nM的探针高浓度区,反而呈下降趋势。表明点样探针浓度为500nM时可获得较好的固定率和杂交效率,因此将制备芯片的探针浓度确定为500nM。7.对银染反应的时间和条件进行了比较研究,证实25℃,5min×5的反应方式能获得较稳定的显色效果。8.临床样品的检测结果显示,阳性探针点及阳性对照点均有显色结果,阴性对照、空白对照和其他探针点均无显影结果,背景清晰,结果可靠。检测结果与常规经典检测鉴定方法结果一致,证明本检测方法准确可靠,可用于临床样品的检测。9.对以下两种纳米金标记方法的效率进行了比较性研究:①用巯基修饰引物的PCR扩增产物进行芯片杂交后,与纳米金的标记结合效率;②用生物素修饰引物的PCR扩增产物进行芯片杂交后,与纳米金标记的抗生物素抗体的结合效率。比较试验结果为:后者虽然在显色过程中借助的连接分子多一个,但显色效果稍微好于前者,分析其原因可能在于生物素结合方法更为经典可靠。以上实验结果表明:该芯片检测技术灵敏度高,特异性好,引物通用性强,检测不需要特殊设备,操作方法简单,能满足临床检测的特异性要求及部分满足通量要求,具有很好的临床应用前景。