嗜酸乳杆菌产细菌素的分离纯化研究

论文摘要

细菌素（Bacteriocins）是细菌在代谢过程中合成并分泌到环境中的一类对同种的或亲缘关系较近的种有抑制作用的杀菌蛋白或多肽物质,细菌素不仅种类丰富,而且在自然界的存在十分普遍,几乎每种细菌均可产细菌素。随着抗生素耐药性问题的加剧,细菌素将在人类疾病防治、动物医药保健及食品防腐等方面体现巨大的应用潜力。本文主要研究了嗜酸乳杆菌细菌素的理化性质、通过单因素实验和正交实验优化培养基配方及培养条件以提高细菌素的效价、以及细菌素的分离纯化路线,具体内容及结果如下：（1）找到一株对指示菌抑菌效果较好的菌株；（2）优化培养基配方及培养条件。对培养基中的葡萄糖,蛋白胨,牛肉膏,氯化钠,碳酸钙,MgSO4·7H2O,柠檬酸三铵,K2HPO4·3H2O, MnSO4·H2O进行正交试验得到优化培养基配方。对细菌素的培养温度,发酵时间,接种量,培养基pH,摇床转速进行单因素实验。最终发现,优化后菌体浓度增加了51.05×107cfu/mL,细菌素效价增加了87.56AU/mL。（3）细菌素理化性质的研究。研究表明该细菌素不仅对革兰氏阳性菌有抑菌作用,而且对革兰氏阴性菌同样有抑菌作用；对蛋白酶敏感,说明该细菌素是蛋白类物质；其对热稳定,在120℃处理30min后还保留抑菌活性；在较大的pH范围内同样保持较高的抑菌活性。（4）摸索到一条分离纯化路线：菌株发酵培养经离心去除菌体,上清液用0.22μm滤菌膜处理后加入固体硫酸按至饱和度为20%,4℃过夜。10000r/min离心,沉淀溶解于去纯净水中。加入固体硫酸铵使其饱和度从20%升至80%,4℃过夜。过夜的硫酸铵饱和液经10000r/min离心,沉淀溶解于纯净水中,收集沉淀,水溶。透析后得到细菌素粗提液,然后利用SephadexG-50凝胶层析柱进行细菌素的纯化。纯化后的细菌素经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,得到单一条带,其分子量约为2.0KDa。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 乳酸菌
• 1.2 嗜酸乳杆菌
• 1.2.1 生物学基本特性
• 1.2.2 嗜酸乳杆菌的分布
• 1.3 细菌素
• 1.3.1 细菌素的定义
• 1.3.2 细菌素的分类
• 1.3.3 产细菌素的菌种及特点
• 1.3.4 细菌素的理化性质
• 1.3.5 细菌素的生物学意义
• 1.3.6 嗜酸乳杆菌细菌素的抗菌谱
• 1.3.7 细菌素与抗生素的区别
• 1.3.8 细菌素的提纯与检测
• 1.3.8.1 细菌素的分离纯化方法
• 1.3.8.2 细菌素的检验方法
• 1.3.9 细菌素的应用前景
• 1.4 细菌素的应用
• 1.4.1 细菌素在食品工业上的应用
• 1.4.2 细菌素在饲料工业上的应用
• 1.4.3 细菌素在医药工业上的应用
• 1.5 展望
• 1.6 课题研究的意义
• 1.7 本论文的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.2.1 斜面培养基
• 2.1.2.2 种子培养基和发酵培养基
• 2.1.3 主要试剂及原料
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的培养
• 2.2.2 嗜酸乳杆菌菌体浓度的测定
• 2.2.3 嗜酸乳杆菌细菌素抑菌活性的测定
• 2.2.4 产细菌素的嗜酸乳杆菌的分离
• 2.2.4.1 嗜酸乳杆菌的初步分离
• 2.2.4.2 乳酸菌素生产菌的筛选
• 2.2.5 细菌素产生菌发酵条件的优化
• 2.2.5.1 培养时间对细菌素产量的影响
• 2.2.5.2 接种量对细菌素产量的影响
• 2.2.5.3 种龄对细菌素产量的影响
• 2.2.5.4 培养基pH对细菌素产量的影响
• 2.2.5.5 培养温度对细菌素产量的影响
• 2.2.5.6 摇床转速对细菌素产量的影响
• 2.2.6 产细菌素培养基优化
• 2.2.6.1 葡萄糖最佳浓度的确定
• 2.2.6.2 复合氮源最佳浓度的确定
• 2.2.6.3 吐温-80对细菌素产量的影响
• 2.2.6.4 添加无机离子对细菌素产量的影响
• 2.2.7 温度、pH及酶对细菌素的影响
• 2.2.8 嗜酸乳杆菌细菌素的分离纯化
• 2.2.8.1 硫酸铵梯度沉淀
• 2.2.8.2 葡聚糖凝胶G-50分离纯化细菌素
• 2.2.9 细菌素分子量的测定
• 2.2.9.1 电泳溶液的配置
• 2.2.9.2 样品的处理
• 2.2.9.3 制胶
• 2.2.9.4 电泳条件
• 2.2.9.5 染色
• 2.2.9.6 脱色
• 2.2.9.7 SDS-PAGE超低分子量标准
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 乳酸菌的分离培养
• 3.2 产细菌素最佳培养条件
• 3.2.1 细菌素效价标准曲线
• 3.2.2 培养时间对细菌素产量的影响
• 3.2.3 接种量对细菌素产量的影响
• 3.2.4 种龄对细菌素产量的影响
• 3.2.5 培养基pH对细菌素产量的影响
• 3.2.6 培养温度对细菌素产量的影响
• 3.2.7 摇床转速对细菌素产量的影响
• 3.3 产细菌素培养基优化
• 3.3.1 葡萄糖最佳浓度的确定
• 3.3.2 复合氮源最佳浓度的确定
• 3.3.3 吐温-80对细菌素产量的影响
• 3.3.4 添加无机离子对细菌素产量的影响
• 3.3.4.1 硫酸镁对细菌素产量的影响
• 3.3.4.2 柠檬酸三铵对细菌素产量的影响
• 3.3.4.3 硫酸锰对细菌素产量的影响
• 3.3.4.4 磷酸氢二钾对细菌素产量的影响
• 3.4 正交试验
• 3.4.1 正交试验因素水平设计
• 3.4.2 正交试验结果与分析
• 3.4.3 验证试验
• 3.5 细菌素的抑菌效果
• 3.6 温度、pH及酶对细菌素的影响
• 3.6.1 细菌素耐温度性的测定
• 3.6.2 不同pH对细菌素的影响
• 3.6.3 不同酶类对细菌素的影响
• 3.7 细菌素分离提取-硫酸铵沉淀
• 3.8 细菌素的初步分离纯化结果
• 3.9 细菌素的纯化
• 3.10 细菌素分子量的测定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢