CHB患者外周血Th17/IL-17表达水平与疾病的关系

论文摘要

Mosmann等人早在20年前即提出:接受抗原刺激后,初始CD4+T辅助细胞（Th）细胞可分化为Th1和Th2两个细胞亚群,Th1主要分泌IL-2、IL-3、IFN-γ,与调控体内细胞免疫息息相关;Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子,促进B细胞活化与类型转换,从而调控机体体液免疫。由IL-12P35和IL-12P40两个亚单位构成的细胞因子IL-12,可通过活化STAT4,刺激下游转录调节子T-bet的表达,从而促进Th1细胞的分化;相反,IL-4可通过活化STAT6,刺激GATA-3的表达而促进Th2细胞的分化。近来,一群新的Th细胞亚群—Th17细胞的发现,促使人们对许多疾病的认识有了新的看法。Th17细胞是一类不同于Th1、Th2而独立存在的CD4+T细胞亚群,主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、TNF-α及GM-CSF,不分泌IL-4、IFN-γ。TGF-β、IL-6、IL-1β和TNF-α可促进Th17细胞的分化;IL-23则在Th17细胞的增殖和存活,以及招募Th17细胞向炎症部位聚集中具有重要作用。影响Th17细胞分化的关键性转录因子为孤儿核受体RORγt,而GATA3、T-bet、Smad7在控制其转录过程中均无作用。目前研究认为,Th17细胞分泌产生的主要效应因子IL-17可刺激IL-8、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1和生长调节因子（Gro）-α等趋化因子的产生,招募中性粒细胞和单核细胞到达炎症部位;亦能通过刺激IL-6、一氧化氮（NO）、前列腺素（PGE）2以及其他促炎因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ和CD40L的表达,从而扩大和加重局部炎症反应。IL-17还可作为机体天然免疫与获得性免疫反应的桥梁,促进T和B细胞的活化增殖,在机体的炎症反应、自身免疫损伤等具有重要的调节作用。慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）在中国是发病率很高的疾病,全国现有1.3亿乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）携带者,3000万乙型肝炎患者。HBV在机体持续性感染以致CHB发生的病理机制尚未完全阐明。HBV是一种非细胞毒性病毒,当其进入机体后常可引起一系列复杂的免疫反应,而机体产生的免疫应答的强弱又与HBV感染所致的不同临床结果密切相关。在这一系列免疫应答中,细胞免疫应答又是决定HBV感染机体后转归的最重要因素,不同的T细胞亚群对病毒抗原的反应状态也不同,即对临床过程的轻重及转归的影响不同。目前很多研究认为Th1/Th2细胞失衡可能是HBV感染慢性化的机制之一;那些最终从急性HBV感染恢复的人表现为Th1型反应,而慢性HBV感染者则以Th2型反应占优势。然而,新发现的Th17细胞亚群是否参与CHB疾病的病理过程,与肝脏炎性损伤是否存在内在关系目前均未见文献报道。本研究采集我院感染性疾病科93例CHB患者（其中CHB患者轻度21例,中度37例,重度35例）及28例健康体检者外周血各7ml,通过检测不同疾病程度CHB患者组与正常对照组外周血中CD4+T细胞IL-17的表达,及与Th17细胞分化相关的细胞因子的表达情况,并分析其表达与肝脏损伤标志物的关系,从而进一步探讨Th17细胞与CHB患者肝脏病理损伤所可能存在的关系。首先,我们主要采用三种研究方法对疾病组和健康对照组外周血Th17细胞/IL-17的表达水平进行检测。采用的检测方法主要包括流式细胞术（FACS）、荧光实时定量聚合酶链反应（Real time PCR）和酶联免疫吸附分析（ELISA）。1、流式细胞术检测各组外周血Th17细胞的表达。我们取各组EDTA抗凝全血100μl,用100μl含10%小牛血清1640培养基稀释后,同时加入50ng/ml PMA、1μg/mlIonomycin和1μl/ml Golgi plug,37度5%CO2孵箱刺激培养5h后标记抗人CD4流式抗体,随后按照BD公司流式穿膜试剂盒操作步骤对细胞内细胞因子IL-17、IFN-γ染色,并进行流式细胞仪检测。结果提示:与正常对照组相比,中重度CHB患者组外周血CD4+IFN-γ-IL-17+T细胞（Th17细胞）比例均明显升高（P＜0.05）,而中度与轻度组、轻度与正常对照组间差异不明显;各组之间CD4+IFN-γ+IL-17T细胞（Th1细胞）比例无明显区别。重度CHB患者CD4+IFN-γ+IL-17+T细胞比例虽高于正常对照,但差异统计学上无显著意义。2、Real time PCR方法检测各组外周血CD4+T细胞内IL-17及Th17细胞分化重要转录因子RORγt的mRNA表达水平。我们利用外周血CD4+T细胞富集试剂盒和淋巴细胞分离液分离出各组外周血CD4+T细胞,在不经任何刺激培养和经抗人CD3抗体及PMA刺激4h的情况下分别对各组CD4+T细胞通过Real time PCR技术进行IL-17、RORγt mRNA水平的定量检测。结果显示:经过刺激培养后,重度CHB患者组IL-17、RORγt的mRNA表达水平高于轻度组和正常对照组（P＜0.05）,且IL-17的mRNA表达在中度与正常对照组间也有差异,但重度与中度组间,轻度与正常对照组间的差异无统计学意义。3、ELISA方法检测外周血血清及CD4+T细胞培养上清IL-17的表达。我们对各组外周血血清及经抗人CD3抗体及抗人CD28抗体刺激72h后的CD4+T细胞培养上清行IL-17 ELISA检测以进一步验证上述结果。我们发现,与流式细胞仪和Real timePCR检测结果类似的是:经刺激培养后重度CHB患者组培养上清IL-17表达水平高于中度、轻度和正常对照组（P＜0.05）;虽然中度组较轻度和正常对照组而言也升高,但变化无统计学意义;轻度组和正常对照组间仍无差别。而外周血血清IL-17的表达各组间差异不明显。其次,由于以上结果均支持中重度CHB患者体内存在着Th17细胞的高表达,因此我们运用Real time PCR技术进一步分析了目前认为和IL-17共表达于Th17细胞的细胞因子IL-22,以及促进Th细胞向Th17细胞分化的相关细胞因子TGF-β、IL-6、IL-1β在各组外周血CD4+T细胞的mRNA表达情况。结果发现:重度CHB患者组CD4+T细胞表达TGF-β、IL-6、IL-1β均高于正常对照组,但差异无统计学意义。当我们将分离出的CD4+T细胞经抗人CD3抗体及PMA刺激4h后,再对上述细胞因子进行检测后结果显示:重度CHB患者组TGF-β、IL-1-表达水平与中度、轻度、正常对照组之间的差异较未经刺激时明显增大,具统计学意义（P＜0.05）,其余各组间的差异不显著;重度组IL-6的表达水平较正常对照组相比也明显升高。而IL-22的表达水平在刺激前后各组间变化均不明显。最后,对以上结果进行分析后我们认为CHB患者体内存在着Th17细胞及其分化相关因子的高表达,值得我们进一步研究其免疫功能与疾病之间可能存在的相互关系。因此,我们进一步对CHB患者组外周血血清HBV DNA载量、肝脏损伤标志物ALT进行检测,并由此分析外周血Th17细胞所占CD4+T细胞比例与患者外周血血清ALT表达水平、HBV DNA载量之间是否存在一定相关性。研究发现疾病组外周血Th17细胞所占比例与其血清ALT水平成正相关（P＜0.01）,而与HBV DNA载量无明显相关性。本研究中,我们首先运用了三种检测方法对疾病组和健康对照组外周血Th17细胞/IL-17的表达水平进行了反复检测和验证。我们的研究结果提示:随着CHB患者疾病严重程度的加大,外周血CD4+IFN-γ-IL-17+T细胞（Th17细胞）所占的比例、经抗人CD3抗体及PMA刺激4h后的CD4+T细胞内IL-17、RORγt的mRNA表达水平、经抗人CD3抗体及抗人CD28抗体刺激72h后的CD4+T细胞培养上清IL-17的表达水平均明显上调。随后,当我们进一步分析与Th17细胞分化相关的细胞因子TGF-β、IL-6、IL-1β以及共表达于Th17细胞内的细胞因子IL-22在外周血CD4+T细胞内的mRNA表达水平时发现:在经过抗人CD3抗体及PMA刺激4h后,重度CHB患者组TGF-β、IL-6、IL-1β表达水平高于正常对照组,而IL-22的表达水平无明显变化。最后,我们进一步研究Th17细胞与CHB患者HBV载量和肝脏损伤的关系时,我们发现患者组外周血Th17细胞所占比例与其血清ALT水平呈正相关（P＜0.01）,而与HBV DNA载量无明显相关性。本研究提示Th17细胞可能在参与CHB疾病的病程进展及肝脏损伤中发挥一定作用。虽然,疾病各组间及轻度与正常对照组之间的差异统计学上无显著意义（这一现象可能在进一步扩大病例数后得到解决）,但从整体趋势上来看,外周血Th17细胞所占比例、CD4+T细胞刺激培养上清IL-17的表达水平及IL-17、RORγt的mRNA表达水平均随疾病加重而升高。由于TGF-β、IL-6、IL-1β为促进Th17细胞分化的重要细胞因子,与此相符的是,我们在研究中也发现重度CHB患者外周血刺激培养的CD4+0T细胞存在着上述细胞因子的高表达。同时,业已有大量文献报道CHB患者外周血血清存在着TGF-β、IL-1β等细胞因子的表达上调,但我们所观察到的CHB患者外周血Th17细胞表达水平的升高是否与此直接相关还值得进一步证实。在本实验研究中,无论是对外周血血清直接检测IL-17,还是对分离出的未经体外刺激的CD4+T细胞直接检测细胞因子的mRNA表达水平,我们都没有检测到疾病组与对照组间统计学意义上的差别;但在经过体外刺激培养后这一差异有了明显的提高,且达到了统计学意义上的区别。由于报道认为HBV感染后发生慢性乙型肝炎时,机体的免疫反应很弱,并不能检测到特异性的T细胞反应。因此,直接对体内状况进行检测时,我们有可能并不能检测到其微弱的变化情况;当我们在体外对CD4+T细胞进行非特异性刺激时,这一变化得到了扩大与增强,其明显差异也能被我们检测到。因此,虽然Th17细胞在外周血CD4+T细胞所占比例并不高,但其在CHB疾病进程中发挥的作用我们并不能忽略。另外,近来的研究报道认为Th17细胞在高表达IL-17的同时,也表现出产生大量的IL-22。然而,与IL-17共表达于Th17细胞的细胞因子IL-22在本研究中并未呈现出与IL-17相应的变化趋势,这一现象目前我们并不能很好的解释。最近也有研究提出体内可能存在着另一群Th17细胞,它们并不高表达IL-22,而主要高表达IL-17。因此,是否我们所发现的这群在CHB患者外周血增高的Th17细胞主要为这样一群细胞?在本研究中这一群仅主要高表达IL-17的CD4+T细胞在CHB患者外周血出现了明显升高,且随患者疾病程度的加重而增加。然而,这样一群主要高表达IL-17的CD4+T细胞—Th17细胞在CHB疾病进展中具体致病性如何?在本研究中,我们发现CHB患者外周血Th17细胞占CD4+T细胞的比例与患者肝脏损伤指标—ALT的表达呈明显正相关,这一现象提示我们Th17细胞在CHB患者肝脏损伤方面发挥重要作用。另外,Th17细胞占CD4+T细胞的比例与HBV病毒载量无明显相关性,这也提示我们可能Th17细胞的多少与病毒含量直接联系并不大,而与病毒感染后引起的免疫反应或者组织损伤有关。但是,Th17细胞和IL-17在CHB患者体内的表达上调及其与ALT表达的正相关性是由于HBV这样一种病毒感染机体后所直接引起还是由于肝脏损伤之后所间接引起的还值得我们进一步研究证实。CHB的发病与多种因素相关,病毒成分、肝脏损伤以及机体免疫系统的相互作用在疾病的持续性发展过程中扮演重要角色。CHB的治疗应包括抗病毒、免疫调节、改善肝功能和抗肝纤维化。一般认为乙型肝炎病毒本身致病性有限,机体在清除病毒的过程中造成的免疫损害是造成肝脏病变的原因。但是在疾病的自然发展及抗病毒药物清除病毒的过程均可发现病毒水平和人体免疫力有相关性。康复时,先出现病毒下降,再出现临床病情缓解;病情复发时,则出现病毒水平上升,然后出现病情加重,说明病毒作用为免疫应答的靶抗原,在决定病情发展过程中起了重要作用。目前对于CHB的治疗主要涉及抑制HBV病毒复制和保肝降酶,然而这一方法很难彻底清除病毒,恢复患者肝脏功能;将抑制病毒复制和重建免疫系统联合起来方能长期有效控制感染,清除病毒。因此,进一步研究Th17细胞和IL-17在CHB发病机理中的作用有望成为帮助CHB患者重建免疫系统的又一新的靶点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 前言
• 论文正文
• 一、研究对象
• 二、实验材料
• 三、方法
• 四、结果
• 五、讨论
• 六、参考文献
• 综述
• 附录
• 致谢