论文摘要
小鼠附植前胚胎发育过程中,DNA甲基化一直处于动态变化中。受精后首先雄原核在DNA复制前发生快速的主动去甲基化,第一次卵裂后,由于缺少维持DNA甲基化的酶—Dnmtl,合子基因组发生被动去甲基化直到桑椹胚,囊胚时内细胞团重新建立甲基化,而滋养层细胞仍然维持低甲基化状态。5-脱氧杂氮胞苷（5-AZA-CdR）是常用的去甲基化试剂,在研究胚胎发育、细胞分化、肿瘤治疗等方面有重要作用。本试验即利用5-AZA-CdR去甲基化的性能研究DNA甲基化与小鼠附植前胚胎发育的关系。通过本试验的研究不仅可以深入理解小鼠胚胎发育与DNA甲基化的关系,而且对于探讨5-AZA-CdR的作用机理、为其更好的应用于肿瘤治疗也有所帮助。1.5-AZA-CdR与小鼠附植前胚胎发育将不同浓度的5-AZA-CdR（0.2,1.0和5.0μM）分别从原核期胚胎、2-细胞期胚胎和4-细胞期胚胎加入,持续作用直至体外发育完毕。结果表明,从原核期加入时,0.2和1.0μM能支持胚胎发育到4-细胞,5.0μM只能支持胚胎发育到2-细胞;从2-细胞期加入时,0.2和1.0μM能支持部分胚胎发育到8-细胞,但8-细胞不能致密化,5.0μM只能支持胚胎发育到4-细胞;从4-细胞期加入时,0.2和1.0μM虽然能支持胚胎发育到早期桑椹胚,但却没有一个能够继续发育到囊胚,而5.0μM处理中,也有部分发育到桑椹胚,但比例显著低于对照组（p＜0.05）。综合以上结果,表明5-AZA-CdR降低了小鼠附植前胚胎的发育能力,尤其对8-细胞期以后的影响更大,并且这种影响是浓度依赖性的。从TUNEL和Annexin-V的检测结果看,5.0μM 5-AZA-CdR处理得到的8-细胞和桑椹胚发生凋亡,而低浓度的5-AZA-CdR则没有引起胚胎的凋亡。说明5-AZA-CdR引起的小鼠早期胚胎发育阻滞一定程度上与它引起的细胞凋亡有关。2.5-AZA-CdR与小鼠附植前胚胎的DNA甲基化采用免疫荧光的方法检测基因组DNA甲基化水平,并用Image软件进行荧光强度的相对定量。从5-MeC免疫荧光的结果来看,5-AZA-CdR处理后,8-细胞和早期桑椹胚（致密化8-细胞）的DNA甲基化水平显著降低（p＜0.05）;但2-细胞和4-细胞胚胎中DNA甲基化水平同对照组相比并没有明显改变（p＞0.05）。因为5-AZA-CdR引起的DNA甲基化变化是通过Dnmtl诱导的,所以对各时期胚胎中Dnmtlo的表达情况进行检测。发现,5-AZA-CdR处理前后Dnmtlo在2-细胞和4-细胞胚胎中都只在细胞质表达;而在8-细胞和早期桑椹胚时,5-AZA-CdR处理后,Dnmtlo从细胞核中消失。说明8-细胞和早期桑椹胚DNA甲基化的降低与Dnmtlo由细胞核中消失有一定的关系。维持DNA正常甲基化对于小鼠附植前胚胎后期（8-细胞、桑椹胚和囊胚）的发育非常重要,而且正常DNA甲基化的维持必须有Dnmtlo的参与。3.5-AZA-CdR与发育相关基因的表达本试验从分子水平上探讨DNA甲基化与小鼠附植前胚胎发育的关系。首先采用BrUTP免疫荧光的方法从基因组整体水平上检测转录活性,发现2-细胞和4-细胞胚胎的转录活性同对照相比没有显著差异（p＞0.05）,而8-细胞和早期桑椹胚的转录活性显著低于对照组（p＜0.05）。进一步选取与胚胎致密化和气穴化关系密切的基因Cx31、Cx43、Cx45、Cdh1和Ctnnb1,进行实时荧光定量PCR确定它们的mRNA表达量的变化。结果表明,5-AZA-CdR处理前后,2-细胞和4-细胞胚的表达量在5个基因都没有变化;从原核期加入5-AZA-CdR得到的5-7细胞的5个基因表达量几乎降到零;从2-细胞期加入5-AZA-CdR得到的非致密化8-细胞胚的5个基因的表达量大幅降低;从4-细胞期加入5-AZA-CdR得到的8-细胞胚的5个基因的表达量有不同程度的降低,当发育到早期桑椹胚时表达量继续降低。说明DNA甲基化不足引起的小鼠胚胎发育阻滞与这5个基因的异常表达有密切关系。