H5N1亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因在植物中的表达

论文摘要

禽流感（Avian influenza,AI）是一种发生于家禽和野鸟中的烈性传染病,近年来禽流感疫情的频繁发生,给世界各国的家禽养殖业和人类公共卫生健康造成了极大的损失和威胁。因此,研究、发展高效、安全、生产工艺简单、价格低廉的禽流感疫苗生产技术体系具有重要的现实意义。随着植物高效表达载体系统和遗传转化技术的不断发展,植物已被用作生产包括疫苗及抗体等在内的一系列重要蛋白的生物反应器,成为植物基因工程中一个重要研究领域。植物作为生物反应器具有许多优点:可大规模生产,贮藏简单,使用方便,可对真核蛋白进行正确的翻译后加工、形成有活性的分子,生产成本低廉,不涉及公众极为关注的有关转基因动物的伦理道德问题,从而使转基因植物成为一种新型、高效的生物反应器。本研究选择我国H5N1亚型禽流感病毒表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因,分别构建到原核表达载体、单子叶植物表达载体和双子叶植物表达载体中,研究了在细菌中经IPTG诱导表达、烟草叶片瞬时表达以及转基因拟南芥稳定表达,分析鉴定了目的蛋白的表达,还探索了小麦愈伤组织的遗传转化。结果表明,HA和NA可以在细菌细胞中正常表达,利用融合蛋白中的GST标签,经亲和层析纯化获得较高纯度的HA和NA蛋白;利用根癌农杆菌—真空过滤法介导的烟草瞬间表达法,从瞬间表达3天后的烟草叶片中提取烟草叶片总蛋白,Western分析证实,HA和NA蛋白均可在烟草叶片中表达积累,在瞬间表达的烟草叶片检测到预期大小的特异蛋白带;以农杆菌介导的Floral dip法,将重组的双子叶植物表达载体转化拟南芥,通过PCR对抗性筛选得到的转化植株进行鉴定,HA和NA转基因的阳性率分别为85.7%和86.7%;提取T2代PCR鉴定阳性植株叶片总蛋白,通过ELISA筛选,分别得到2株表达量较高的转基因植株;对其进行RT-PCR鉴定和Western杂交检测,证实了HA和NA的正常转录和表达;进一步通过根癌农杆菌介导法转化小麦愈伤组织,筛选得到的转化植株经PCR初步鉴定,证实了目的基因整合到小麦的基因组中。因此,禽流感病毒表面抗原血凝素和神经氨酸酶基因可在植物细胞中瞬间和稳定表达。这些研究结果为利用植物作为生物反应器生产禽流感植物疫苗打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 禽流感与禽流感病毒
• 1.1.2 禽流感疫苗的研究概况
• 1.2 转基因植物疫苗的原理和策略
• 1.2.1 转基因植物疫苗的原理
• 1.2.2 转基因植物疫苗表达系统
• 1.3 影响农杆菌介导单子叶植物转基因效率的因素
• 1.4 筛选标记基因
• 1.4.1 标记基因的安全性问题
• 1.4.2 安全标记基因pmi
• 1.5 转基因植物疫苗研究现状
• 1.5.1 大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位（LT-B）在植物中的表达
• 1.5.2 乙肝表面抗原（HBsAg）在植物中的表达
• 1.5.3 口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白VP1在植物中的表达
• 1.6 转基因疫苗存在的问题及展望
• 1.6.1 选择强启动子和非组成型启动子
• 1.6.2 根据密码子的简并性选择植物偏爱的基因序列
• 1.6.3 利用某些特定调控序列增强表达
• 1.6.4 植物膜泡运输机制靶向表达抗原蛋白
• 1.7 本研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 培养基及试剂
• 2.1.5 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒 DNA提取
• 2.2.2 DNA片段回收
• 2.2.3 感受态细胞制备及转化
• 2.2.4 PCR扩增
• 2.2.5 GST蛋白诱导表达及纯化
• 2.2.6 烟草叶片瞬时表达
• 2.2.7 拟南芥转化及筛选
• 2.2.8 拟南芥叶片DNA提取
• 2.2.9 转基因拟南芥的RT-PCR检测
• 2.2.10 叶片总蛋白的提取及纯化
• 2.2.11 ELISA
• 2.2.12 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.13 Western blot
• 2.2.14 农杆菌介导的小麦幼胚转化
• 2.2.15 转化后愈伤组织的恢复培养、筛选及分化
• 2.2.16 抗性植株的壮苗、春化及移栽
• 2.2.17 转化苗的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 HA、NA基因的扩增
• 3.2 原核表达与纯化
• 3.2.1 原核表达载体的构建
• 3.2.2 原核表达条件试验
• 3.3 植物表达载体的构建并转化根癌农杆菌
• 3.3.1 双子叶植物表达载体的构建
• 3.3.2 单子叶植物表达载体的构建
• 3.4 烟草瞬时表达及Western blot杂交检测
• 3.5 拟南芥转化、筛选及分子水平和蛋白水平的鉴定
• 3.5.1 拟南芥转化、筛选及PCR鉴定
• 2代转基因拟南芥的ELISA筛选'>3.5.2 T₂代转基因拟南芥的ELISA筛选
• 2代转基因拟南芥的RT-PCR检测'>3.5.3 T₂代转基因拟南芥的RT-PCR检测
• 2代转基因拟南芥的Western blot杂交检测'>3.5.4 T₂代转基因拟南芥的Western blot杂交检测
• 3.6 小麦幼胚愈伤组织的转化和筛选
• 3.6.1 农杆菌转化小麦幼胚愈伤组织
• 3.6.2 转化后愈伤组织的恢复培养、筛选及分化
• 3.7 小麦幼苗的CPR检测
• 3.8 小麦幼苗的PCR检测
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢