黄海鱼类寄生异尖属线虫幼虫及内弯宫脂线虫的分子鉴定

论文摘要

作者对采自2005年5月到2006年10月的黄海鱼类寄生异尖属线虫幼虫及内弯宫脂线虫进行了分子分类学鉴定,在对鱼类寄生线虫进行形态学分类的基础上,从202条隶属于30种鱼体内挑选出785条异尖属线虫幼虫用于PCR-RFLP （聚合酶链反应-限制性片段长度多态性）分析,并在具代表性的8个不同的鱼类宿主挑选出48条形态上有差别的内弯宫脂线虫进行rDNA ITS区序列测定分析。结果如下:通过对所选异尖属线虫幼虫rDNA的ITS区进行PCR-RFLP分析,主要用内切酶Hinf1进行酶切,依据酶切片段长度的多态性和部分样品的序列测定,得出的实验结果显示黄海鱼类寄生异尖属线虫幼虫共有三个基因型:派氏异尖线虫Anisakis pegrefii,典型异尖线虫Anisakis typica及派氏异尖线虫Anisakis pegrefii与简单异尖线虫A. simplex sensu stricto的杂交体。其中Anisakis pegrefii是优势种,785个异尖属线虫幼虫样品中有770个为Anisakis pegrefii,约占总数的98%,在斑头Agrammus agrammus （Temminck & Schlegel）,白姑Argyrosomus argentatus （Houttuyn）,舵鲣Auxis thazard（lacépède）等29种所检鱼类体内均有发现。Anisakis typica数量较少,共3条,宿主为舵鲣Auxis thazard（lacépède）,绿鳍鱼Chelidonichthys kumu。杂交体共12条,宿主为白姑Argyrosomus argentatus （Houttuyn）,舵鲣Auxis thazard（lacépède）,高眼鲽Cleisthenes herzenstein,大头鳕Gadus macrocephalus Tilesius,青鳞Harengula zunasi Bleeker,鲈鱼Lateolabrax japonicus （Cuvier & Valenciennes）,海鳗Muraenesox cinereus （Forskal）,带鱼Trichiurus haumela （Forskal）,日本海魴Zeus japonicus Cuvier &Valencienn。其中Anisakis pegrefii与A. simplex sensu stricto的杂交体为国内首次发现。选用内弯宫脂线虫的48个样品是根据其侧翼,胃盲囊和肠盲囊的比值,交合刺的长度,尾尖等形态的不同值所筛选出来的,线虫宿主为鮟鱇 Lophius litulon （Jordan）,鳕鱼Gadus macrocephalus Tilesius,高眼鲽Cleisthenes herzensteini （Schmidt）,六线鱼Hexagrammos otakii Jordan & Starks,黑鮶 Sebastodes fuscescens （Houttuyn）,马鲅Scomberomorus niphonius （Guvie& Valenciennes）,鬼鮋 Inimicus japonicus （Cuvier& Valenciennes）,绵鳚Zoarces elongatus Kner8种鱼类。经过对内弯宫脂线虫的rDNA ITS-1和ITS-2进行rDNA的ITS区序列测定,结果表明来自不同宿主且形态有所差异的所有内弯宫脂线虫在分子水平上无差异,这些形态上的差异可能是由线虫不同的发育阶段及不同宿主对线虫的影响所造成的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 异尖科线虫幼虫形态分类学研究进展
• 2 异尖科线虫幼虫的分子分类学研究进展
• 2.1 现代生物学技术
• 2.2 异尖属线虫幼虫
• 2.3 宫脂属线虫幼虫
• 2.4 对盲囊属线虫幼虫
• 3 异尖线虫病
• 3.1 治病机理及病理变化
• 3.2 异尖线虫过敏原研究进展
• 第二章 PCR-RFLP 结合序列分析对黄海鱼类寄生异尖属线虫进行种类鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验用线虫材料
• 2.1.2 酶类及试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 线虫标本的采集
• 2.2.2 线虫标本的固定与保存
• 2.2.3 线虫标本的鉴定
• 2.2.4 样品材料的处理和DNA 提取
• 2.2.5 PCR 扩增异尖线虫的rDNA ITS 区（包括5.8s,ITS-1 ,ITS-2，28S）
• 2.2.6 琼脂糖电泳分析
• 2.2.7 样品PCR 扩增产物的纯化
• 2.2.8 PCR 样品的酶切鉴定
• 2.2.9 代表性异尖属线虫样品的rDNA ITS-1 和ITS-2 区的PCR 扩增及序列测定
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR 扩增rDNA ITS 片段
• 3.2 PCR 样品的酶切结果分析
• 3.3 异尖属线虫代表性样品rDNA ITS-1 和ITS-2 的PCR 扩增结果
• 3.4 序列测定与分析
• 4 讨论
• 第三章 黄海鱼类寄生内弯宫脂线虫rDNA ITS 区序列分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 试剂
• 2.2.1 酶试剂
• 2.2.2 分子生物学试剂盒
• 2.2.3 DNA 分子量标准
• 2.2.4 缓冲液见第二章2.1.2.4
• 2.2.5 其它试剂见第二章2.1.2.5
• 2.2.6 仪器设备见第二章2.1.3
• 2.3 方法
• 2.3.1 样品材料的处理和DNA 提取
• 2.3.2 虫体材料的裂解见第二章2.2.4.1
• 2.3.3 内弯宫脂线虫样品rDNA ITS-1 和ITS-2 片段的PCR 扩增
• 2.3.4 琼脂糖电泳分析
• 2.3.5 代表性内弯宫脂线虫样品的rDNA ITS 1 和ITS-2 片段的序列测定
• 2.3.6 DNA 序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR 扩增rDNA ITS-1 区和ITS-2 片段
• 3.2 序列分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢