论文摘要
第一部分视黄酸缺乏斑马鱼胚胎模型的建立为了深入研究视黄酸缺乏对心脏发育的影响,我们首先探索建立视黄酸缺乏的斑马鱼胚胎模型。视黄醛脱氢酶2（raldh2）是关键的视黄酸合成酶,我们以raldh2为切入点,通过化学遗传学方法和基因knock-down两种途径,抑制raldh2,阻断视黄酸的合成,从而造成斑马鱼胚胎发育过程中视黄酸缺乏,为进一步观察研究视黄酸缺乏对胚胎发育的影响奠定基础。首先,我们选用raldh2抑制剂——对二乙氨基苯甲醛（DEAB）外源性处理斑马鱼胚胎。我们观察到:外源性DEAB处理可以导致斑马鱼胚胎发育异常,且随着DEAB处理浓度升高、处理时点前移,胚胎死亡率和畸形率逐渐上升。在斑马鱼胚胎孵育至原肠胚期,DEAB处理可导致心脏发育异常,表现为心前区水肿、心脏发育呈管状、无向右环化或环化不完全、心房心室大小异常、心搏减弱、血流缓慢等,并出现体节弯曲、头部畸小、胸鳍缺失异常表型。外源性视黄酸能有效援救DEAB的致畸作用,从而证实DEAB处理能有效特异地抑制视黄酸合成,造成斑马鱼胚胎发育过程中视黄酸缺乏。其后,我们利用吗啡啉修饰的反义寡核苷酸（MO）技术在整体水平knock-down raldh2基因表达,设计了raldh2-MO和对照MO（con-MO）。我们发现,随着raldh2-MO显微注射剂量增加,胚胎死亡率和畸形率逐渐上升,并出现较一致的表型,表现为心前区水肿、心脏发育呈管状、无向右环化或环化不完全、心房心室大小异常、心搏减弱、血流缓慢等,并出现体节弯曲、头部畸小、胸鳍缺失等畸形,这些表型与DEAB处理组相似,而con-MO注射组胚胎没有出现明显畸形。通过荧光蛋白融合标记实验进一步验证raldh2-MO抑制raldh2基因表达的有效性和特异性。通过外源性DEAB处理和raldh2-MO显微注射两种方法都能有效特异地抑制视黄酸合成,从而成功建立起视黄酸缺乏的斑马鱼胚胎模型。第二部分视黄酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏发育的影响在前期实验基础上,我们利用斑马鱼胚胎透明,在显微镜下能直接动态观察整个心脏发育过程的独特优势,全面分析了视黄酸缺乏对胚胎发育,尤其是心脏早期发育的影响。我们首先观察了胚胎心脏异常表型。与野生型胚胎比较,DEAB处理组和raldh2-MO组胚胎心脏发育异常,出现心包腔水肿、部分心脏呈线性管状、无向右环化或环化不完全、心房心室发育异常、房室管血液返流、血流缓慢、心脏搏动减弱等表型,提示视黄酸缺乏影响了心房心室分化、心管环化、瓣膜发育以及心肌收缩等多个重要环节。其次,通过斑马鱼胚胎心率和心室收缩分数比较,分析视黄酸缺乏对胚胎心脏功能的影响。我们发现,野生型胚胎心脏搏动有力,心律规则,随着心脏发育心率逐渐加快。DEAB组和raldh2-MO组胚胎心脏搏动节律规则,但心室率下降,心室收缩乏力,两组胚胎心室率和心室收缩分数与对照组相比差异均有统计学意义,P＜0.05。提示视黄酸缺乏后心肌收缩力降低、胚胎心脏功能受损。我们选择amhc（atrial myosin heavy chain）、vmhc（ventricular myosin heavychain）和nppa（natriuretic peptide precursor A）心脏特异标记基因,通过整体胚胎原位杂交方法,进一步分析视黄酸缺乏对心脏分子表型的影响。与野生型胚胎比较,视黄酸缺乏的胚胎心脏amhc表达范围缩小,vhmc表达细胞范围扩大,nppa在心室部位表达明显,而在心房部位表达降低甚至无表达。提示视黄酸缺乏改变了心脏特异基因的表达,干扰了正常的房室分化。最后,通过大体表型、阿尔新兰染色和HuC探针整体原位杂交方法,分析了视黄酸缺乏胚胎的其他表型特征。胚胎表现出胸鳍发育不良甚至完全缺失、咽弓发育异常,第3-7对咽弓体积减小,数目不同程度减少、胚胎头部畸小,神经元标记HuC在脑部表达范围减少,以后脑部位表达减少最为明显。第三部分raldh2 knock-down对心脏发育相关T-box基因表达的影响视黄酸与一些心脏发育相关转录因子间存在一定的调控作用,从而影响心脏的正常发育。tbx1、tbx5和tbx20是T-box基因家族成员,该家族基因在心脏谱系确定、腔室分化、瓣膜形成、心外膜发育以及传导系统分化等方面发挥重要作用。我们构建斑马鱼tbx1、tbx5及tbx20探针,通过胚胎整体原位杂交方法分析raldh2 knock-down后这些基因表达的变化,初步探讨tbx1、tbx5和tbx20基因表达是否受视黄酸信号的调控,从而参与心脏的发育。结果发现,tbx5基因在野生型斑马鱼胚胎心脏后部的心房和胸鳍芽部位表达,raldh2 knock-down后,胚胎出现心房发育不良和胸鳍短小、甚至完全缺失的表型,tbx5基因表达明显减弱。tbx1基因在野生型斑马鱼胚胎咽弓、心脏流出道、耳囊表达,raldh2 knock-down的胚胎中tbx1表达减弱、表达范围减小。在斑马鱼胚胎发育中tbx20基因在心脏、运动神经元、顶盖、视网膜中表达。心脏心房、心室和流出道部位均有tbx20表达。raldh2 knock-down后tbx20在这些部位的表达减弱,在心脏中心室部位tbx20表达范围减小,心房和流出道表达亦明显减弱。tbx5、tbx1和tbx20在胚胎心脏中表达,其表达水平受到视黄酸信号的调控,在视黄酸缺乏的情况下,这些基因出现了表达下调,影响心脏的正常发育。视黄酸信号与T-box基因之间存在着一定的调控作用,在心脏发育的分子机制中发挥重要作用,然而在这一调控机制中是否有其他心脏转录因子参与,T-box基因成员之间是否存在相互作用,目前仍不明确,将有待于今后进一步的关注和研究。