抗氯霉素单克隆抗体的制备及一步式化学发光酶免疫分析方法的建立

论文摘要

氯霉素（Chloramphenicol, CAP）作为一种有效的广谱抗生素,曾广泛的应用于畜牧业。但由于氯霉素对人类具有严重的毒副作用,被世界各国明令禁止在食品动物中使用。为了严格控制氯霉素残留情况,建立一种高效、灵敏、快速、特异的药物残留检测技术成为当务之急。化学发光酶免疫分析技术具有化学发光测定技术的高灵敏度与免疫反应的高特异性等优点,适用于临床检测中所有酶免疫分析和放射免疫分析的检测项目,是这两种方法的替代升级产品,具有较好的发展前景。本研究以人工合成的氯霉素-牛血清白蛋白（CAP-HS-BSA）免疫BALB/c小鼠；三免后,以间接ELISA方法测定免疫小鼠的血清效价,均达到1:1.28×105,说明小鼠获得了较好的免疫效果；取效价最高的免疫小鼠的血清进行间接竞争ELISA测定,血清半抑制浓度（IC50）在100～1000μg/L之间。采用细胞融合技术将效价最高的小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞进行融合,融合率为22.9%。经过间接ELISA筛选,获得分泌抗CAP的强阳性杂交瘤细胞株1株,经克降3次后,选择细胞生长状态良好,克降阳性率达100%的细胞株,命名为5D7。对杂交瘤细胞培养上清进行了效价测定与亚类鉴定,分泌的抗体亚类为IgG1、κ链,细胞培养上清效价为1:512。采用体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体,纯化后对抗体进行了效价、亲和性和特异性测定。结果显示,腹水经纯化后效价为1:2×105,亲和常数为3.6×108L/mol,与L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、青霉素、四环素、庆大霉素等结构类似物及常见抗生素的交叉反应率小。利用制备的抗CAP单克隆抗体5D7建立了一步式检测氯霉素的化学发光酶免疫分析法,并进一步优化抗原包被条件、抗体工作浓度、竞争反应时间等实验参数,获得CLEIA的线性回归方程为y=-12.188x+62.988,R2=0.9909,IC50=11.63μg/L,该方法显示在0.001～10μg/L有较好的线性关系,检出限为0.0061μg/L,回收率在95.61～108.46%之间。该方法与常规两步法相比,在不影响检出限和灵敏度的前提下,减少了操作步骤,缩短了实验时间,更符合快速检测的要求。本研究应用细胞融合技术成功获得了一株分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其进行亲和性、灵敏性和特异性测定,同时利用该抗体建立了检测氯霉素残留的一步式化学发光酶免疫分析法。该方法可基本满足我国水产品中氯霉素残留检测限的要求,为氯霉素化学发光试剂盒的研发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 常用缩写词
• 1 前言
• 1.1 氯霉素的性质及早期应用
• 1.2 氯霉素的危害及其影响
• 1.3 氯霉素的残留现状及其影响
• 1.4 动物性食品中氯霉素残留的检测方法
• 1.4.1 微生物法
• 1.4.2 物理化学方法
• 1.4.3 免疫分析法
• 1.5 化学发光免疫分析法的研究
• 1.5.1 化学发光酶免疫分析方法
• 1.5.2 化学发光免疫分析法在氯霉素残留检测中的应用
• 1.6 实验的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料及溶液的配制
• 2.1.1 实验动物与细胞
• 2.1.2 仪器与耗材
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法的基本操作步骤
• 2.2.1 间接ELISA方法的基本操作步骤
• 2.2.2 间接竞争ELISA方法的基本操作步骤
• 2.2.3 一步式间接竞争化学发光酶免疫分析法的基本操作步骤
• 2.2.4 两步式间接竞争化学发光酶免疫分析法的基本操作步骤
• 2.3 氯霉素单克隆抗体的制备与鉴定
• 2.3.1 动物免疫
• 2.3.2 免疫效果测定
• 2.3.3 细胞融合
• 2.3.4 杂交瘤细胞株的筛选与培养
• 2.3.5 杂交瘤细胞培养上清的鉴定
• 2.3.6 单克隆抗体的腹水制备与纯化
• 2.3.7 单克隆抗体免疫学特性的鉴定
• 2.4 氯霉素化学发光酶免疫分析法的建立
• 2.4.1 化学发光酶免疫分析法实验条件的优化
• 2.4.2 化学发光酶免疫分析法实验标准曲线的绘制
• 2.4.3 化学发光酶免疫分析法方法学的比较与鉴定
• 3 结果
• 3.1 氯霉素单克隆抗体的制备与鉴定结果
• 3.1.1 免疫效果鉴定
• 3.1.2 细胞融合与杂交瘤细胞的筛选结果
• 3.1.3 杂交瘤细胞培养上清的鉴定结果
• 3.1.4 单克隆抗体的纯化与鉴定结果
• 3.1.5 单克隆抗体免疫学特性的鉴定结果
• 3.2 氯霉素化学发光酶免疫分析法的建立
• 3.2.1 化学发光酶免疫分析法实验条件优化结果
• 3.2.2 化学发光酶免疫分析法实验标准曲线的建立
• 3.2.3 化学发光酶免疫分析法方法学比较与鉴定结果
• 4 讨论
• 4.1 免疫抗原的选择
• 4.2 细胞融合条件的控制
• 4.3 杂交瘤细胞的筛选
• 4.4 化学发光条件的优化
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文情况