转基因棉花对棉田土壤细菌群落结构及纤维素降解菌影响的初步研究

论文摘要

转基因棉花的培育成功为作物病虫害的防治带来了一场新的革命,对中国和世界棉花的生产都起到了极其重要的推动作用,产生了巨大的经济效益和社会效益。然而,由于转基因品种的复杂性和不可预见性而导致的潜在风险也已引起了科学家的高度重视,世界各国普遍要求转基因棉花释放前必须经过严格的生态风险性评估。土壤微生物是土壤的重要组成部分,转基因棉花对土壤微生物的影响是安全评价体系中不可缺少的组成部分。纤维素降解菌是土壤中一类重要的微生物菌群,其对秸秆还田、能量物质循环等均起到关键性的作用。目前,大田条件下转基因棉花对土壤微生物区系（包括纤维素降解菌）的影响尚不明确,亟待研究。本文应用PCR-DGGE技术结合聚类分析、主成份分析等统计分析方法检测了单价（CrylA）、双价（Cry1A+CpT1）转基因棉及其亲本在不同生育期对土壤细菌群落结构的影响。结果表明：无论是转基因棉还是其亲本,土壤细菌的种类和数量在整个生育期内均随温度的升高和棉花的生长而相应变化,在生长旺盛期（主要是花铃期）出现特异类群；统计分析结果显示在同一生育期内,转基因棉及其亲本的DGGE图谱相似性较高,说明转基因棉花对土壤细菌群落结构的影响不显著。采用羧甲基纤维素钠-刚果红平板培养计数法研究转基因棉对土壤纤维素降解菌数量的影响。结果表明：单价、双价转基因棉及其亲本的土壤纤维素降解菌数量在整个生育期中的变化规律基本一致一一苗期最低,蕾期上升,花铃期达到最高值,吐絮期下降；SPSS统计分析显示在同一生育期内,转基因棉花对纤维素降解菌的生长有一定的促进作用,但仅在个别生育期（苗期、蕾期）表现出显著差异（P<0.05）。为研究转基因棉花对土壤纤维素降解酶活性的影响,采用PNPG法检测土壤中p-葡萄糖苷酶的活性。研究结果显示：单价、双价转基因棉及其亲本的土壤p-葡萄糖苷酶活性在整个生育期中的变化与纤维素降解菌数量的变化趋势基本一致；转基因棉花的种植对土壤p-葡萄糖苷酶活性的影响在部分生育期表现显著,大多是促进作用,但也有例外；影响程度依转基因品种及距主根距离的不同而有所差异。从转基因棉及其亲本土壤中分离得到了3株具有较高纤维素总酶活性（以滤纸为底物）的降解菌株,分别命名为XWS-3、XWS-9和XWS-10。通过16S rRNA基因系统发育分析将3个菌株分别鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、链霉菌属（Streptomycessp.）和壤霉菌属（Agromyces sp.）。后续试验将以这3株菌作为指示菌株,分别针对它们的纤维素降解酶基因设计特异性引物,通过实时定量PCR技术检测降解酶基因的变化,结合本文内容,建立转基因棉花安全评价体系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 文献综述
• 1 转基因棉花概况
• 1.1 转基因棉花研究进展
• 1.1.1 Bt基因
• 1.1.2 转基因棉花研究历程
• 1.2 转基因棉花发展现状
• 1.2.1 国外种植情况
• 1.2.2 国内种植情况
• 1.3 转基因棉花的经济和社会效益
• 2 转基因棉花的安全性问题
• 2.1 转基因棉花安全性研究
• 2.1.1 Bt杀虫蛋白的时空表达
• 2.1.2 Bt基因逃逸风险
• 2.1.3 靶标害虫对Bt棉产生抗性进化的风险
• 2.1.4 Bt棉花对非靶标生物体的影响
• 2.2 转基因棉花安全性检测方法简介
• 3 土壤微生物群落结构研究现状
• 3.1 土壤微生物多样性
• 3.2 土壤微生物多样性研究方法
• 3.2.1 传统培养分离方法
• 3.2.2 生物标记物方法
• 3.2.3 BIOLOG鉴定系统
• 3.2.4 分子生物学方法
• 3.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 3.3.1 变性梯度凝胶电泳技术发展及原理
• 3.3.2 DGGE技术的优缺点
• 3.4 转基因棉花对土壤微生物群落结构的影响
• 4 土壤酶活性研究现状
• 4.1 土壤酶概述及研究现状
• 4.2 关于纤维素降解菌
• 4.2.1 纤维素的结构
• 4.2.2 纤维素降解菌
• 4.3 纤维素酶系及其作用机制
• 4.3.1 纤维素酶的组成
• 4.3.2 纤维素酶的结构
• 4.3.3 纤维素酶的作用机制
• 4.4 纤维素酶活力检测方法
• 4.4.1 纤维素总酶活的检测
• 4.4.2 单一组分酶活力检测
• 参考文献
• 实验部分
• 第一章 PCR-DGGE技术检测转基因棉花对土壤细菌群落结构的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 供试作物
• 1.1.2 供试土壤
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要试剂及培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 试验设计
• 1.2.2 试验原理及步骤
• 1.3 试验数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 土壤细菌总DNA的提取和纯化
• 2.2 细菌16S rRNA基因V3区PCR扩增
• 2.3 PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 2.3.1 单价转基因棉GK-12和亲本SM距棉花根部不同距离土壤样品的DGGE分析
• 2.3.2 单价转基因棉GK-12和亲本SM距棉花根部不同距离土壤样品的DGGE图谱聚类分析
• 2.3.3 单价转基因棉GK-12和亲本SM距棉花根部不同距离土壤样品的主成份分析
• 2.3.4 价转基因棉33B和亲本5415距棉花根部不同距离土壤样品的DGGE分析
• 2.3.5 价转基因棉33B和亲本5415距棉花根部不同距离土壤样品的DGGE图谱聚类分析
• 2.3.6 双价转基因棉33B和亲本5415距棉花根部不同距离土壤样品的主成份分析
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第二章 转基因棉花对土壤纤维素降解菌数量的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 供试作物
• 1.1.2 供试土壤
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要试剂及培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 试验设计
• 1.2.2 试验原理及步骤
• 1.3 试验数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 纤维素降解菌在羧甲基纤维素钠-刚果红平板上的生长情况
• 2.2 不同生育期棉田土壤纤维素降解菌数量的变化
• 2.3 转基因棉花与亲本对照的土壤纤维素降解菌数量的差异
• 2.4 讨论分析
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第三章 转基因棉花对土壤纤维素降解酶活性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 供试作物
• 1.1.2 供试土壤
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要试剂及培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 试验设计
• 1.2.2 试验原理及步骤
• 1.3 试验数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 对-硝基酚标准曲线的制作
• 2.2 不同生育期棉田土壤β-葡萄糖苷酶活性的变化
• 2.3 转基因棉花与亲本对照的土壤β-葡萄糖苷酶活性差异
• 2.4 讨论分析
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 土壤纤维素降解菌的筛选、分离及初步鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 供试作物
• 1.1.2 供试土壤
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要试剂及培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 试验设计
• 1.2.2 试验原理及步骤
• 1.3 试验数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 纤维素降解菌的分离和纯化
• 2.2 复筛——DNS法检测纤维素总酶活性
• 2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.2.2 纤维素总酶活性（以滤纸为底物）的测定
• 2.3 土壤纤维素降解菌的初步鉴定
• 2.3.1 16S rRNA基因的PCR扩增
• 2.3.2 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析
• 3 本章小结
• 参考文献
• 全文总结
• 本论文的创新点及不足之处
• 附录一 文中所用培养基及试剂配方
• 附录二 相似性矩阵
• 附录三 相关DNA序列
• 攻读硕士学位期间发表或已接收的学术论文
• 致谢