论文摘要
分枝杆菌具有特殊的细胞壁结构,其核心部分由肽聚糖、聚阿拉伯糖半乳糖和分枝菌酸组成,其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通过衔接双糖（L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺）共价连接到肽聚糖大分子上。UDP-N-乙酰葡糖胺是N-乙酰葡糖胺的糖基供体,而glmU基因编码的GlmU蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶活性,参与UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成过程。本实验室张文利的研究结果表明,glmU基因为分枝杆菌生长必需基因,因此,GlmU可作为研发抗结核新药的作用靶标。为了深入研究GlmU酶活性对分枝杆菌细胞壁结构和组成的影响并建立筛选GlmU酶抑制剂的细胞模型,本实验室已构建了glmU反义RNA表达载体pMind-glmU-AS,glmU反义RNA在耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）的表达受四环素的调控。为了优化四环素浓度对glmU反义RNA表达的调节,需要用抗GlmU抗体检测GlmU在耻垢分枝杆菌中的表达量。本论文的目的是:（1）用PCR法从耻垢分枝杆菌mc2155菌株基因组DNA中扩增glmU基因,构建pMD18-glmU克隆载体;（2）将glmU基因亚克隆到pET29b表达载体中,在宿主菌BL21（DE3）中诱导表达GlmU重组蛋白。用亲和层析法纯化重组GlmU蛋白,并用Western Blotting方法鉴定GlmU重组蛋白;（3）用纯化的GlmU蛋白免疫小鼠以制备抗GlmU的多克隆抗体;（4）用不同剂量的四环素诱导glmU反义RNA在耻垢分枝杆菌中的表达,用抗GlmU抗体检测GlmU在耻垢分枝杆菌中的表达量。本论文所获得结果如下:1. glmU基因的扩增和pMD18-glmU克隆载体的构建用结核分枝杆菌GlmU的氨基酸序列从TIGR的耻垢分枝杆菌mc2155菌株基因组数据库中获得mc2155菌株的glmU基因的核苷酸序列（1449 bp）。根据该序列设计一对PCR引物,并在上游与下游引物的5’端分别引入Nde I和XhoI限制性内切酶位点。用保真度高的LA Taq DNA聚合酶,以mc2155菌株基因组DNA为模板扩增了glmU基因,并将glmU基因连接到pMD18-T载体,构建了pMD18-glmU克隆载体。对glmU基因进行DNA测序测定,结果表明利用PCR技术扩增出正确的mc2155 glmU基因。2.表达载体pET29b-glmU的构建用Nde I和Xho I双酶切pMD18-glmU质粒,回收和纯化glmU基因,将其连接到pET29b表达载体的Nde I和Xho I位点,构建了pET29b-glmU表达质粒。GlmU蛋白的C端与质粒上的组氨酸标签形成融合蛋白。3. GlmU蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达和纯化将pET29b-glmU质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中,用IPTG诱导携带pET29b-glmU质粒的BL21（DE3）表达重组蛋白。用超声方法破碎诱导后的BL21（DE3）,对上清和沉淀组分进行SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明GlmU蛋白在BL21（DE3）中可溶性表达。采用组氨酸-Ni2+亲和层析技术纯化GlmU蛋白,对纯化的GlmU蛋白进行蛋白质定量（考马斯亮蓝法）,第1 ml GlmU蛋白的浓度为0.635 mg/ml。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明GlmU蛋白的纯度高。4.抗GlmU蛋白的多克隆抗体的制备将纯化的GlmU蛋白质溶液经过特殊处理后制备成免疫用抗原,免疫BalB/C小鼠,制备抗血清,通过间接法酶联免疫吸附试验测得抗血清的抗体滴度为1:51200,采用抗血清及偶联碱性磷酸酶的马抗小鼠IgG二抗对耻垢分枝杆菌总蛋白中GlmU进行Western Blotting分析,结果表明制备的GlmU多克隆抗体特异性高。5. glmU反义RNA的诱导表达与GlmU蛋白的检测分别用5 ng/ml、10 ng/ml和20 ng/ml的四环素诱导携带pMind-glmU-AS表达载体的mc2155菌株表达反义RNA,绘制细菌生长曲线,结果表明20 ng/ml浓度的四环素可抑制mc2155/pMind-glmU-AS的生长,但Western Blotting分析结果显示经四环素诱导和未诱导的mc2155/pMind-glmU-AS中,GlmU蛋白表达量无明显的变化。结论:在本研究中,我们构建了pET29b-glmU表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达出大量的可溶性耻垢分枝杆菌GlmU蛋白。用纯化的GlmU蛋白免疫BalB/C小鼠,成功地制备了抗GlmU蛋白的多克隆抗体,并将抗GlmU蛋白抗体应用到检测四环素诱导表达glmU反义RNA的系统中,初步研究了GlmU蛋白表达水平与耻垢分枝杆菌生长速率之间的关系,这一研究成果为我们进一步研究GlmU酶蛋白活性与分枝杆菌细胞壁结构和组成的关系奠定了基础。