论文摘要
研究背景大叶钩藤Uncaria macrophylla Wall.属于茜草科Rubiaceae钩藤属Uncaria植物,《中华人民共和国药典》2010年版收载,作为中药正品钩藤来源的一个种。大叶钩藤主要分布于广东、广西、云南等省,具有清热平肝、息风定惊之功效,是中医临床治疗肝风内动,惊痫抽搐的常用中药。作为中药钩藤,传统的药用部位是带钩茎枝,但最近的研究发现钩藤叶这一部位的化学成分与带钩茎枝相似,并且钩藤叶远比钩藤带钩茎枝的产量高,可见钩藤叶作为一种药用资源,来源丰富,药用价值及综合利用潜力都很大。目前由于缺乏对钩藤叶进行系统的药学和药理毒理学研究,使其一直没有被开发利用,大量的钩藤叶资源一直处于废弃状态。而在钩藤属药用植物及近缘种中,大叶钩藤叶的重量和产量最大。目前有关大叶钩藤叶的药理作用尚未见报道。研究目的对大叶钩藤进行资源调查,进行大叶钩藤叶生药学研究和主要化学成分测定,并在此基础上,对大叶钩藤药理作用进行初步研究,主要观察其对中枢神经的影响和抗药物依赖的作用,为该药的进一步开发利用提供实验依据。实验方法1.大叶钩藤主要分布于华南及西南地区。应用植物分类学与植物地理学方法,就近选点,在粤西地区进行大叶钩藤资源丰度,利用状况及生态环境等方面的调查,并采集制作腊叶标本。2.生药学鉴定方法：采集大叶钩藤药材标本,对钩藤叶进行性状鉴别,显微鉴别采用石蜡切片法观察叶片主脉及叶肉组织结构、采用水合氯醛透化法观察叶片粉末特征、采用表面撕片法观察叶面气孔及表皮细胞形态,理化鉴别采用生物碱沉淀反应及硅胶薄层层析色谱法对大叶钩藤中生物碱进行比较。3.主要化学成分测定：采用HPLC法测定大叶钩藤不同部位有效成分钩藤碱、异钩藤碱含量,色谱柱为Hypersil ODS C18柱（4.6mm×200mm,5um）;甲醇—水（含0.5%三乙胺,冰乙酸调PH6.334）=63：37为流动相,流速0.8ml·min-1,进样量为5.0μl,检测波长为245nm,柱温为室温。4、大叶钩藤对中枢神经系统的影响4.1小鼠自发活动实验昆明种小鼠60只,雌雄各半,禁食12h,饮水不限。将小鼠随机分为6组,即空白对照组（等容量生理盐水组）,阳性药组（地西泮1mg/kg）,钩组（即大叶钩藤带钩茎枝,下同）组（20g/kg）和大叶钩藤叶低（5g/kg）、中（10g/kg）、高（20g/kg）三剂量组,每组10只动物。将各组小鼠放入YLS-IA多功能小动物自主活动记录仪中,适应5min后,测定小鼠给药前的自主活动次数,记录时间为5min。记录时室内保持安静。然后按剂量给各组小鼠灌胃给药。分别于给药后30min、60min、120min各测定1次自发活动数,记录5min内各组小鼠的活动数。4.2戊巴比妥钠阂下睡眠剂量诱导小鼠入睡试验取昆明种小鼠55只,雌雄大致各半。将小鼠随机分为5组,即空白对照组（等容量生理盐水组）,阳性药组（地西泮lmg/kg）,钩组（即大叶钩藤带钩茎枝,下同）组（20 g/kg）和大叶钩藤叶低（5g/kg）、高（20g/kg）剂量组,每组11只动物。按各组剂量给小鼠ig给药,药后60mmin后给每只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg,以小鼠翻正反射消失lmin以上为入睡标准,记录15min内各组小鼠的入睡个数。4.3戊巴比妥钠阈剂量诱导小鼠睡眠时间试验取昆明种小鼠40只,雌雄各半,分组同上,每组8只动物。按各组剂量给小鼠ig给药,药后60min后给每只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠50mg/g,然后记录各组小鼠的睡眠时间（以给药后小鼠翻正反射消失为入睡时间,翻正反射消失至恢复为睡眠时间）。4.4硫酸士的宁致小鼠惊厥试验：取昆明种小鼠75只,雌雄大致各半,分组同上,每组15只动物。按各组剂量给小鼠ig给药,给药后60min,腹腔注射硫酸士的宁（2mg/kg）,记录注射士的宁后2h内惊厥小鼠数和死亡小鼠数,惊厥反应以小鼠出现四肢阵挛或强直性惊厥为指标。5.大叶钩藤对小鼠苯丙胺依赖位置偏爱效应（CPP）及脑内单胺递质的影响取经过自然位置偏爱测定合格的SPF级昆明小鼠,按随机分组原则分为①空白对照组,②苯丙胺模型组,③模型组+大叶钩藤带钩茎枝组（20mg/kg）,④模型组+大叶钩藤叶高剂量组（20mg/kg）,⑤模型组+大叶钩藤叶低剂量组（5mg/kg）,⑥大叶钩藤纯钩组（20mg/kg）,每组10只,雌雄各半。②-⑤组偶数天上午（8：00）腹腔注射（ip）苯丙胺（2mg·kg-1）,奇数天上午（8：00）腹腔注射（ip）等体积生理盐水,⑥组按相应剂量灌胃（ig）给予大叶钩藤钩提取物；③-⑤组于每日下午20：00（即给苯丙胺后12 h）,分别按相应剂量灌胃（ig）给予大叶钩藤提取物；①组以同体积生理盐水替代苯丙胺给药,其它处理同②组。整个过程共持续8d,实验期间小鼠饮水进食自由。实验时将位置偏爱箱中间的隔板放下,d1上午注射生理盐水、苯丙胺及灌胃给予钩藤碱后立即将小鼠置于白箱,d2上午注射及灌胃给予生理盐水后立即将小鼠置于黑箱,放置时间均为45min。以后的6d均按上述方法操作,共8d。在d9上午8：00（即最后一次给予苯丙胺24 h后）进行位置偏爱检测,通过动物行为学分析系统记录并分析小鼠15 min内在白箱中停留的时问。完成CPP测定后,立即将各组小鼠麻醉后快速断头处死,迅速剥取全脑,置液氮中冷冻1分钟后,放于-80℃保存待测。测试时取小鼠大脑部分,称重,匀浆,经离心等处理后制成样品溶液,用荧光分光光度法测定样品中NE、DA、5-HT的含量。6.统计方法：应用SPSS13.0统计软件处理数据,实验数据以x±s表示,采用配对t检验、重复测量方差分析,单因素方差分析,先对数据进行方差齐性检验,方差齐则应用Anova法进行检验,用LSD法进行组间两两比较；如方差不齐,则应用近似方差分析的welch法进行检验,应用Dunnett’s T3法进行两两比较。计数资料采用x2检验。p<0.05表示差异有统计学意义。结果1.对大叶钩藤进行资源调查发现,广东罗定西部蕴藏丰富的大叶钩藤资源,当地无污染性工业,生态环境优良,植被保存比较完好,且有深厚的民间用药文化背景,应积极保护资源并进一步合理开发利用。对大叶钩藤叶进行生药学研究结果发现,大叶钩藤叶叶片较大,含众多单细胞非腺毛,栅栏组织细胞2-3列,叶片薄璧细胞含草酸钙簇晶,平轴式气孔,薄层层析显示与钩藤对照药材至少有2种相同的生物碱成分。2、大叶钩藤生物碱含量的HPLC结果表明,钩藤碱和异钩藤碱在0.02μg-5μg范围内线性关系良好,r钩藤碱=0.9999,r异钩藤碱=1.0000,平均回收率分别为98.52%和99.12%,RSD钩藤碱=2.045%,RSD异钩藤碱=2.171%。钩藤碱含量大叶钩藤叶为0.016%,大叶钩藤带钩茎枝为0.015%,异钩藤碱含量大叶钩藤叶为0.006%,大叶钩藤带钩茎枝为0.004%。3药物对中枢神经系统的影响3.1药物对小鼠自主活动的影响处理组之间采用重复测量方差分析,重复因素四个水平数据不满足球对称假设（P=0.009）,取Greenhouse-Geisser校正结果。处理组间差异有统计学意义（F=4.187,P=0.003）,四个时间点间差异有统计学意义（F=71.010,P<0.001）,时间因素和组别之间不存在交互效应（F=1.605,P=0.091）。在每一时间点上不同处理组间的差异采用One-Way ANOVA,给药前与药后30min两个时间点方差齐（P=0.238,0.215）,六个处理组之间差异无统计学意义（F药前=2.209,P药前=0.067；F药后30min=0.987,P药后30min-0.434）；药后60min方差齐（P=0.102）,六个处理组之间差异有统计学意义（F=3.346,P=0.009）,空白组均高于其余五组（P=0.009,0.001,0.001,0.002,0.008）,其余五组之间差异无统计学意义（P值均大于0.05）；药后120min方差齐（P=0.199）,六个处理组之间差异有统计学意义（F120min=3.538,P120min=0.008）,空白组均高于带钩茎枝组、阳性药组、叶低剂量组、叶高剂量组（P<0.001,P=0.004,0.017,0.005）。每一组在不同时间点上活动次数的差异用重复测量方差分析,空白组在各时间点上数据不满足球对称假设（P=0.022）,取Greenhouse-Geisser校正结果,四个时间点间差异有统计学意义（F=4.010,P=0.018）；至药后60分钟与给药前差异有统计学意义；阳性药组数据满足球对称假设（P=0.077）,四个时间点间差异有统计学意义（F=9.261,P<0.001）；至药后60分钟与给药前差异有统计学意义。带钩茎枝组、叶低剂量组、叶中剂量组、叶高剂量组数据均满足球对称假设（P=0.179,0.865,0.085,0.294）,四个时间点间差异有统计学意义（F=11.901,P<0.001；F=17.515,P<0.001；F=21.998,P<0.001；F=14.332,P<0.001）,均至药后30分钟与给药前差异有统计学意义。总的来说,小鼠的活动次数在给药前后不同时间之间有差异,六组均在给药前达到最大值,除空白组外其余五组给药后活动次数随时间呈下降趋势,至120min达到最小值。带钩茎枝组以及叶各剂量组于30分钟即与给药前差异有统计学意义,阳性药组至药后60分钟与给药前差异有统计学意义,大叶钩藤组起效时间较快。3.2戊巴比妥钠阈下睡眠剂量诱导小鼠入睡实验空白对照组在腹腔注射阈下睡眼剂量的戊巴比妥钠（30mg/kg）后,翻正反射消失小鼠为0只,阳性药组有6只小鼠入睡,钩组有7只小鼠入睡,叶低剂量组有5只小鼠入睡,高剂量组有4只小鼠入睡。由于有50%格子理论频数小于5,取Fisher确切概率法结果,P=0.015,差异有统计学意义,可认为5个实验组之间的差异有统计学意义。3.3戊巴比妥钠阈剂量诱导小鼠睡眼时间实验各组小数睡眠时间数据经One-Way ANOVA分析表明组间有差异有统计学意义（F=5.676,P=0.001）,需进一步两两比较（采用LSD法）。空白对照组与钩藤叶低剂量组、带钩茎枝组差异无统计学意义（P=0.959,P=0.274）,与阳性药组、叶高剂量组比较差异有统计学意义（P=0.004,P=0.001）。结果表明,叶高剂量组可使戊巴比妥钠阈剂量所致小鼠睡眠持续时间延长,且与阳性药组比较差异无统计学意义（P=0.569）3.4药物对硫酸士的宁致小鼠惊厥作用的影响给小鼠腹腔注射士的宁（2mg/g）后,小鼠在5min内出现强直性惊厥和死亡。各组小鼠存活个数经X2检验,50%格子数小于5,取Fisher确切概率法结果,P=0.133,差异无统计学意义,可认为5个实验组之间的小鼠惊厥个数差异无统计学意义。各组小鼠惊厥时间经One-Way ANOVA分析,levene检验方差不齐,用近似F检验Welch法,P=0.003,组间差异有统计学意义,经两两比较,阳性药组与空白对照组、带钩茎枝组、高剂量组比较差异有统计学意义,其余四组间差异无统计学意义,叶低剂量组与阳性药组比较差异无统计学意义（P=0.142）,但与其余3组比较亦差异无统计学意义,尚不能认为它们之间药效相似。4.药物对小鼠苯丙胺依赖位置偏爱效应（CPP）的影响给药前各组数据方差不齐（P=0.022）,取Welch结果P=0.309,差异有统计学意义。空白对照组小鼠给药前后在伴药箱中的停留时间无明显变化（P=0.162）。与给药前比较,模型组小鼠给药后在伴药箱中的停留时间明显延长（P=0.002）。表明模型组小鼠对白箱产生CPP,小鼠苯丙胺CPP模型建立成功。与给药前比较,低剂量组、高剂量组、带钩茎枝组、纯钩组小鼠给药后在伴药箱中的停留时间差异无统计学意义。与空白对照组比较,模型组小鼠给药后在伴药箱中的停留时间明显延长（P=0.001）；而钩藤碱低剂量组及高剂量组小鼠给药后在伴药箱中的停留时间与之比较无明显差异。带钩茎枝组、低剂量组带钩茎枝组、纯钩组给药后在白箱中的停留时间与模型组比较差异有统计学意义（P<0.001,P=0.006,P<0.001）。用One-Way ANOVA对各组单胺神经递质含量测定结果进行分析,各组NE、DA、5-HT数据方差齐（P=0.738,P=0.120,P=0.072）、各组间比较差异有统计学意义（P<0.001,P<0.001,P=0.033）。用LSD进行多重比较,与空白对照组比较,模型组NE、DA含量均升高（P<0.001）,5-HT含量降低（P=0.033）；模型+钩组NE含量升高（P=0.044）。纯钩组、模型+钩组、模型+高、低剂量组NE含量低于模型组（P<0.001）；纯钩组、模型+钩组、模型+高、低剂量组DA含量低于模型组（P=0.002、P<0.001、P=0.001、P<0.001）；纯钩组、模型+钩组5-HT含量高于模型组（P=0.002、P=0.01）；模型+高剂量组、模型+低剂量组的5-HT含量与模型组比较有升高趋势,但差异无统计学意义（P=0.169,P=0.069）。结论1、大叶钩藤资源丰富,大叶钩藤叶的性状鉴别和显微特征均具有形态学规律,可作为对其进行生药鉴定的实验依据。生物碱沉淀反应和薄层层析色谱分析结果表明,大叶钩藤叶与钩藤对照药材在生物碱方面至少有两种相同的成分。2.大叶钩藤中钩藤碱与异钩藤碱含量较高,本HPLC法准确,操作简便、快速,重复性较好,精密度较高,可用于对钩藤属植物的总生物碱以及有效成分钩藤碱、异钩藤碱含量的测定。3、大叶钩藤醇提物能够显著降低小鼠的自主活动,增加翻正反射消失的小鼠数,延长小鼠睡眠时间。但不能减少硫酸士的宁引起的惊厥小鼠的死亡数以及硫酸士的宁致小鼠惊厥的潜伏时间。4.苯丙胺能使受试动物产生明显的位置偏爱效应,小鼠于伴药箱中停留时间延长。大叶钩藤可以缩短成瘾小鼠在伴药箱中的停留时间,抑制苯丙胺小鼠依赖状态下的CPP效应,使之与正常小鼠差异无统计学意义。而正常小鼠给予大叶钩藤并不会产生CPP,说明其本身并无成瘾性。递质含量测定结果显示,模型组小鼠大脑区DA、NE、5-HT含量均有异于空白对照组,提示此三种单胺类递质与苯丙胺依赖相关。纯钩组、模型+钩组、模型+高、低剂量组NE、DA含量低于模型组,纯钩组、模型+钩组5-HT含量高于模型组,大叶钩藤各组均能在一定程度改善各递质含量的变化,使之趋于正常水平。