寒温并用复方对急性病毒性心肌炎的防治作用及机制研究

论文摘要

研究背景和目的研究背景:禽流感病毒和流感病毒都是通过呼吸道侵入人体引起呼吸道和（或）全身感染的病毒。面对呼吸道病毒感染逐渐增多、传染性逐渐增强、病情逐渐加重的趋势,如何寻找有效的预防和治疗对策,减轻病毒感染造成的损害,是中西学者共同面临的挑战。病毒性心肌炎（Viral myocarditis,VMC）是病毒侵犯心脏引起的以心肌炎性病变为主的一种疾病。多种病毒都可引起心肌炎,现在研究表明心肌炎发病以流感病毒最为多见。到目前为止,对其机制尚未明确,且缺乏值得信赖的治疗方法和药物,从中草药中寻找治疗该病的药物是一条新的治疗病毒性心肌炎途径。中医药防治病毒性传染病具有一定的优势,寒温并用法是邓铁涛教授临证多年之学术精萃。临床研究证实,寒温并用中药复方具有抗流感病毒活性。以往实验研究显示,中药复方不仅在体外有直接的抗病毒活性,而且初步证实其对心肌炎有治疗作用。实验室禽流感病毒模型建立存在很多的安全隐患,我们目前实验室的安全状况不能满足对禽流感病毒模型的研究。甲1型流感病毒（H1N1）与禽流感病毒同属正粘病毒科甲型流感病毒,亲缘关系较近。尽管甲1型流感病毒能引起急性呼吸道传染性疾病,但是它对于工作人员及环境在一定实验室条件下并无任何威胁,因此我们考虑用H1N1替代禽流感作为我们模拟禽流感病毒感染诱发病毒性心肌炎模型的建立。本课题正是基于以上背景立题,试图建立安全的体内禽流感病毒感染诱发心肌炎替代模型,从实验角度客观评价寒温并用中药复方的作用环节,部分阐明其抗流感病毒感染的机制,为进一步推广应用提供科学依据。研究目的:建立甲型流感病毒FM1株诱导小鼠心肌炎模型,在此基础上进一步深入研究寒温并用中药复方提取物对Balb/c小鼠FM1诱导病毒性心肌炎的防治作用,并探讨其作用机制,为研究寒温并用复方对禽流感的防治作用及器官保护,特别是复方对禽流感诱导心肌炎的防治作用的研究打下良好的基础。实验研究部分方法1采用FM1流感病毒诱导Balb/c小鼠心肌炎,应用光镜和电镜病理观察方法,结合ELISA法检测血清肌钙蛋白cTnI浓度含量,鉴定小鼠病毒性心肌炎模型。2将小鼠随机分成6组,中药复方提取物以灌胃给药途径治疗心肌炎小鼠14天,观察药物对各组小鼠一般状态、体重、14天存活率、心脏质量/体质量、心脏组织光镜和电镜病理改变的影响,并计算病理积分。3采用ELISA法,检测小鼠血清中NO、TNF-α的含量,探讨中药复方提取物对细胞因子的影响作用。4采用荧光定量PCR（FQ-PCR）技术,检测各组小鼠治疗后心肌组织中FM1、TNF-α的表达情况,探讨中药复方提取物干预病毒复制和调控细胞因子的作用。结果1模型的建立本研究发现模型组小鼠血清cTnI水平在小鼠感染流感病毒后第3天即有升高,7～10天达高峰,14天仍维持较高水平,与正常对照组比较,有显著性差异（P＜0.01）。病理改变有炎性细胞浸润,心肌细胞水肿和坏死。2药物对FM1流感病毒诱导心肌炎小鼠的预防治疗作用（1）在改善心肌炎一般状态方面,四组药物都表现出明显的治疗作用。药物治疗组小鼠的活动、精神状态、饮食、体重与模型对照组比较,均明显改善;在改善体重方面,各治疗组与模型组比较,中药高中低剂量组第3天～14天的体重与模型组相比均有显著改善（P＜0.05;P＜0.01）,病毒唑组在感染的第7天～14天体重明显高于模型组（P＜0.01）;高剂量组与中剂量组比较体重虽有增加,但无统计学意义,高剂量组第10,14天的体重明显高于低剂量组和病毒唑组,差异具有显著性（P＜0.05）。说明中药复方可以改善心肌炎小鼠体重,且呈一定的量效关系。（2）在提高感染小鼠生存率方面。四个治疗组的生存百分率均高于模型组,差异具有显著性（P＜0.05）;四组间的生存率差异不显著（P＞0.05）。（3）在保护心肌细胞、减轻免疫损伤方面。四组药物的心脏/体质量比值与病毒模型对照组相比,均有显著差异（P＜0.01）;中药高剂量组的心指数明显低于中药低、中剂量组,差异具有显著性（P＜0.01）,病毒唑组的心指数明显低于中药中剂量组和中药低剂量组（P＜0.05,P＜0.01）;中药高剂量组与病毒唑组的心指数差异不显著（P＞0.05）。四个治疗组的病变总面积/所测心肌总面积比值明显低于模型组,差异具有显著性（P＜0.01）。四个治疗组间比较,差异具有显著性（P＜0.05）;复方中剂量组、高剂量组、病毒唑组病变比值明显低于低剂量组,有显著性差异（P＜0.05,P＜0.01）;而复方中、高剂量组、病毒唑组比较,差异不显著（P＞0.05）;提示中剂量组和高剂量组在减轻心肌病理损伤方面均优于低剂量组。电镜超微结构表明与模型组相比,药物组心肌细胞中肌丝和线粒体结构破坏明显减轻。说明四组药物具有不同程度的保护心肌细胞作用,复方中剂量组和高剂量组药物表现更明显。（4）中药复方对FM1流感病毒诱导Balb/c小鼠心肌炎有预防效果（P＜0.05）。3四组药物对心肌炎小鼠血清中NO、TNF-α含量的影响（1）模型组小鼠血清中NO含量与正常组比较明显增高,差异具有显著性（P＜0.01）。四个治疗组的NO含量与模型组相比,明显降低,均有显著差异（P＜0.05,P＜0.01）;中药中、高剂量组、病毒唑组NO含量与中药低剂量组比较,明显降低,均有显著差异（P＜0.01）;而复方中、高剂量组、病毒唑组比较,差异不显著（P＞0.05）。（2）模型组小鼠血清中TNF-α含量与正常组比较明显增高,差异具有显著性（P＜0.01）。四个药物组的TNF-α含量与模型组相比,明显降低,均有显著差异（P＜0.01）;中药高剂量组表现更明显,与其他各组比较,表现明显优势（P＜0.05）。4复方治疗后小鼠心肌组织中FM1、TNF-α基因相对表达量与模型组相比,中药复方高、中、低剂量组能明显的降低心肌炎小鼠心肌组织中的FM1、TNF-α表达量（P＜0.01）。结论1采用FM1流感病毒滴鼻感染Balb/c小鼠可成功诱导病毒性心肌炎;采用病理、电镜和检测血清肌钙蛋白cTnI浓度含量的检测方法鉴定病毒性心肌炎模型是一种简单可行的鉴定方法。2在改善心肌炎一般状态方面,四组药物都表现出明显的治疗作用。药物治疗组小鼠的活动、精神状态、饮食、体重与模型对照组比较,均明显改善。在提高感染小鼠生存率方面。四个治疗组的生存百分率均高于模型组,四组间的生存率差异不显著。在减轻心肌病理损伤和保护心肌细胞作用方面,四个治疗组都表现出明显的作用,复方中剂量组和高剂量组药物表现更明显。3中药复方高、中、低三个剂量组能显著降低病毒性心肌炎小鼠血清中NO、TNF-α的含量,减轻对心肌细胞的损伤。4中药复方高、中、低剂量组均能明显的降低心肌炎小鼠心肌组织中的FM1、TNF-α表达量,且呈一定的量效关系。临床研究部分目的研究病毒性心肌炎的中医证候特征及变化规律,在此基础上进行证候特征量化的研究,并探讨有效、实用的中医临床诊断治疗方案。方法（1）对病毒性心肌炎的常见症状及体征进行等级评定。（2）对每个研究对象详细填写“病毒性心肌炎中医证候研究观察表”,并将所有症状、体征进行证候归类。（3）运用统计学方法分析年龄、病程与中医证候的关系及不同中医证候中症状、体征分布情况。（4）以病毒性心肌炎中医证候研究的结果为基础,明确疾病分期,确立治法方药,探讨有效、实用的中医临床诊疗方案。结果（1）112例患者常见的主症依次为乏力（54.46%）、胸闷憋气（49.11%）、心悸（29.46%）、头晕（25.00%）、面黄唇淡（24.11%）、胸痛（21.43%）、脉结代（13.40%）、多汗（9.82%）;常见的次症依次为咽部红肿（75.90%）、舌质（88.39%）舌苔（72.32%）异常、发热（25.89%）、咳嗽（22.33%）、大便不调（19.64%）、脘痞呕恶（9.82%）、肌肉疼痛（8.04%）。（2）112例病毒性心肌炎患者常见的中医证候依次为:邪犯心肺（68.75%）、气阴不足（24.11%）、心脉瘀阻（7.14%）。（3）急性期以邪犯心肺证最为常见,急性期与迁延期的中医证候分布比较,具有统计学意义,差异具有显著性（P＜0.01）。（4）邪犯心肺证患病率随着病程的加长逐渐降低,气阴不足证及心脉瘀阻证患病率随着病程的加长逐渐增加,对上述中医证候患病率的趋势作统计意义检验,均有统计学意义,差异具有显著性（P＜0.01）。结论病毒性心肌炎的常见中医证候可归纳为邪犯心肺、气阴不足和心脉瘀阻三种类型。乏力、面色、胸闷憋气、心痛、咽部症状、脘痞呕恶、舌苔、脉象（指纹）以及病程对中医证候有较好的鉴别作用;对上述症状、体征及病程做判别分析,可对中医证候进行较准确的判别;根据中医证候分类及其变化规律,确立病毒性心肌炎的治疗大法为初期寒温并用、祛除邪毒、兼顾正气;中后期补虚扶正,兼祛实邪。创新性本课题具有一定的特色和创新性:首先是流感病毒感染诱导小鼠心肌炎模型的建立。本实验建立的动物模型在国内尚未见有关报道,因此建立流感病毒感染诱导小鼠心肌炎模型,将填补此方面的空白,为筛选有效中西药物创造首要条件。本模型具有以下优点:容易建立、重复性好、安全、实验周期短、价格便宜,而且不造成生物灾害,易于推广且一次可以建立大量模型。这对于评价抗流感病毒性心肌炎药物,特别是对药物的初步筛选有其优势。本模型还在一定程度上符合呼吸道病毒感染的中医证候,对于评价中药抗病毒复方,尤其是评价寒温并用中药复方抗病毒及保护器官的作用具有一定参考价值。本课题建立的流感病毒感染模型虽非禽流感病毒,但与禽流感病毒有着一定的相关性。为今后进行禽流感病毒对心肌损伤的研究做一些相应的实验基础工作,为大规模研究提供实验依据。其次,本课题运用寒温并用法防治病毒性心肌炎,具有创新性。本实验采用FM1流感病毒诱发心肌炎模型,对中药复方防治病毒性心肌炎及其量效关系的部分机制从临床疗效层次摸索出了新思路;初步探讨了寒温并用中药复方对心肌保护作用及机理,对今后进一步研究提供了运用动物模型实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献研究
• 一 中医学对病毒性心肌炎的研究
• 1 中医对病毒性心肌炎的认识
• 2 中药治疗病毒性心肌炎实验研究进展
• 3 病毒性心肌炎中医诊疗方案
• 二 现代医学对病毒性心肌炎的研究
• 1 病毒性心肌炎发病
• 2 病毒性心肌炎的发病机制
• 3 成人急性病毒性心肌炎诊断参考标准
• 4 病毒性心肌炎治疗方案
• 三 寒温并用法在临床中的应用
• 1 寒温并用法治疗外感热病
• 2 寒温并用法治疗病毒性心肌炎
• 第二部分 实验研究
• 实验一 FM1流感病毒诱导Balb/c小鼠病毒性心肌炎动物模型的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 中药复方提取物急性毒性实验
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 中药复方提取物对FM1诱导Balb/c小鼠心肌炎的预防及治疗作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验四 中药复方提取物对心肌炎小鼠血清中NO、TNF-α含量的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验五 中药复方提取物对心肌炎小鼠心肌组织FM1及TNF-α表达的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 临床研究
• 病毒性心肌炎的中医证候分析
• 1 资料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结语
• 参考文献
• 附录1: 中英文名词术语对照
• 50滴定'>附录2: 甲型流感病毒FM1株传代与LD₅₀滴定
• 附录3: 光镜图
• 附录4: 电镜图
• 附录5: 荧光定量PCR标准曲线的构建与样本基因相对表达量的测定
• 附录6: 病毒性心肌炎临床诊断标准
• 附录7: 病毒性心肌炎中医证候研究观察表
• 附录8: 病毒性心肌炎证候特征分级标准
• 在学期间发表论文情况
• 致谢