家蚕第二白卵近等基因系差异表达基因的筛选与克隆

论文摘要

家蚕（Bombyx mori）是人类完全驯化并得以充分利用的一种重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫的模式生物。随着家蚕基因组与功能基因研究的深入,家蚕转基因技术在基础科学研究和蚕丝产业领域的应用需求越来越迫切。转基因阳性个体的高效检测技术是建立家蚕转基因育种技术的核心之一,如果能利用可以肉眼观察的质量性状（如卵色、眼色、斑纹等）的基因,结合利用RNA干扰等技术,建立并采用可肉眼观察性状作为选择标志的转基因筛选技术,将有效提高筛选效率,有助于家蚕转基因技术的发展和应用。本课题研究的家蚕第二白卵（w-2:10-16.1）,其卵色为黄白色略带淡红,蛾的复眼白色,卵色眼色与正常型十分容易区分,呈普通遗传。第二白卵对孵化、生命力、经济性状等方面的影响都很小,适合用作转基因个体筛选的标志基因,但目前对家蚕第二白卵形成的分子机制尚无了解,为此,本研究利用正常型黑卵及其第二白卵近等基因系,联合运用抑制消减杂交技术和cDNA基因芯片检测技术,探索家蚕第二白卵性状相关的基因信息,以期为进一步阐明第二白卵性状形成的分子机制、开发新型转基因标记技术提供参考。主要研究结论如下:一、家蚕黑白卵抑制消减杂交文库构建及分析为了获得家蚕第二白卵与正常型黑卵之间的差异表达基因信息,以正常型黑卵为实验组（tester）,第二白卵近等基因系为参照组（driver）,采用转色期（24h-48h）蚕卵构建正向消减文库。从文库中随机挑选300个阳性克隆,对部分克隆测序,获得了107个序列信息。对107个克隆的cDNA序列进行同源性分析结果表明,消减文库中这些基因序列与家蚕基因组或EST序列具有高度同源性。在107个阳性克隆中,18个cDNA序列在2个克隆中出现,总出现频次占克隆总数的33.65%,文库富集性较好,推测文库中这些基因序列代表了黑白卵材料差异表达较大的基因。二、利用家蚕cDNA基因芯片检测技术筛选黑白卵差异表达基因随机选用300个消减文库序列的PCR产物制作家蚕cDNA基因芯片,按照荧光交换标记设计进行cDNA芯片检测,对24h和48h卵龄黑白卵差异表达基因进行筛选,获得了黑白卵差异表达基因11个,其中24h差异表达基因2个,48h差异表达基因10个。三、差异表达基因的同源性分析对获得的11个黑白卵差异表达的候选基因进行了cDNA序列扩增,其中7个候选基因的序列在消减文库序列基础上得到了延伸,获得了差异表达基因更多的序列信息。在NCBI等数据库中对11个候选基因进行BLAST分析,其中5个序列是未知基因（Unknown）;2个序列与推定蛋白（hypothetical protein）基因同源;4个序列与功能基因（Unigenes）高度同源。同源基因的生物物种除了家蚕外,还有谷蛀虫、冈比亚按蚊、镰状疟原虫、玉米、摇蚊。四、差异表达基因的实时荧光定量PCR分析对芯片检测获得的11个差异表达候选基因在家蚕黑白卵品系转色期（24h和48h）蚕卵的表达水平进行实时荧光定量RT-PCR验证分析,结果表明大部分基因定量结果与芯片结果倾向一致,极少部分与芯片结果相反。目的基因在黑卵品系中的表达量是白卵品系中的0.14倍到7951.4倍,其中差异倍数最大的是J241文库序列。蚕卵发育到第24h和48h时,J241基因在黑卵中的表达量分别是白卵中的5753和7951倍。J241基因在24h和48h的黑卵中的表达量约为内参基因Bmactin A3的0.7倍左右,是一种大量表达的基因,而在白卵中J241相对于内参基因的表达量非常低,几乎可以认为不表达。五、差异表达基因J241的克隆及序列分析利用用消减文库测序获得的J241的原始序列（137bp）,利用cDNA末端快速扩增技术获得了J241基因的3’端序列（240bp）,生物信息学分析表明该序列由两个外显子拼接而成。通过在不同外显子之间和外显子内部设计不同引物对黑卵和白卵进行RT-PCR检测并测序,结果证明黑白卵之间存在不同的拼接方式,白卵中只有一种序列,而黑卵除了含有白卵相同序列类型的产物外,还有1种黑卵特有的序列类型,是在白卵类型序列中间插入239bp的特有序列所致。六、J241基因在黑白卵中的表达差异定量分析利用J241基因不同外显子之间和外显子内部设计不同引物进行实时荧光定量RT-PCR,对黑白卵品系转色期蚕卵J241基因差异表达进行定量分析,结果显示白卵类型序列在黑白卵品系均有表达,表达量差异较小,而黑卵特有的序列类型只在黑卵中大量表达,白卵中不表达,是黑白卵中明显的差异表达基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 家蚕基因组与功能基因研究概况
• 1.1.1 家蚕基因组研究意义
• 1.1.2 家蚕卵色及遗传研究概况
• 1.2 差异表达基因分析方法
• 1.2.1 抑制消减杂交技术
• 1.2.2 基因芯片检测技术
• 1.2.3 RACE 技术
• 1.2.4 实时荧光定量PCR 技术
• 1.2.5 电子克隆
• 1.3 课题研究意义
• 第2章 仪器设备、药品试剂和主要实验技术
• 2.1 主要实验仪器设备
• 2.2 主要实验试剂和药品
• 2.2.1 主要试剂和试剂盒
• 2.2.2 常用溶液及缓冲液的配制
• 2.2.3 培养基的制备
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3 主要技术方法和技术原理
• 2.3.1 抑制消减杂交技术（SSH）
• 2.3.2 PCR 产物克隆、鉴定
• 2.3.3 cDNA 微阵列技术
• 2.3.4 cDNA 末端快速扩增（RACE）
• 2.3.5 RT-PCR
• 2.3.6 实时荧光定量RT-PCR
• 第3章 利用抑制消减杂交和cDNA 芯片检测技术筛选差异表达基因
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 第二白卵近等基因系的建立
• 3.1.2 实验材料的准备与总 RNA 的提取
• 3.1.3 抑制消减杂交cDNA 文库的构建
• 3.1.4 消减 PCR 产物的克隆
• 3.1.5 基因芯片制作的材料准备
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 总RNA 的提取
• 3.2.2 抑制消减杂交文库的构建及分析
• 3.2.3 cDNA 芯片试验结果分析
• 2.2.4 差异表达基因的同源性分析
• 3.3 本章小结
• 第4章 差异表达基因的实时荧光定量PCR 分析及候选基因的序列分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 总RNA 的制备及cDNA 合成
• 4.1.2 实时荧光定量PCR 分析
• 4.1.3 cDNA 末端快速扩增技术
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 实时荧光定量RT-PCR 结果
• 4.2.2 J241 基因扩增序列分析
• 4.3 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文
• 致谢
• 详细摘要