靶向人FoxMlc的多肽先导药物筛选与分子模拟

论文摘要

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的重大疾病。在与肿瘤相关的各类转录因子中,Fox家族蛋白成员众多,其突变和表达异常与发育畸形、代谢性疾病以及肿瘤发生密切相关。FoxM1作为Forkhead家族的一个特殊成员在肿瘤等活跃的分裂细胞中大量表达,是控制包括增殖、成熟、死亡在内的整个细胞生命周期的重要基因之一,与肿瘤生长和转移密切相关。目前,国内外对FoxM1的研究尚处于起步阶段。本研究对于深入了解FoxM1c的生物信息基础和进一步的靶向FoxM1c药物研究具有重要的意义和价值。通过NCBI FoxMlc基因的蛋白质序列查询,选出8条来自不同物种具有代表性的序列,确定了不同物种中表达FoxM1c基因之间的同源关系,并发现FoxM1c基因或功能区域在其它物种中的表达。同时,依据ClustalX等生物信息学软件对人FoxMlc基因蛋白序列的理化性质、结构以及功能进行预测。研究结果表明,人FoxM1c蛋白序列共有748个氨基酸组成,人FoxM1c蛋白序列的两大功能域分别为“叉头框”（Forkhead,236-314）和转录激活区（AD,688-748）,“叉头框”是一个非常好的保守区域。p19ARF蛋白的26-46的氨基酸残基能与AD相结合,从而约束人FoxM1c和减少人FoxM1c对细胞核靶向作用的转录活性。进一步地,通过对人FoxM1c全长片段、DNA结合区和转录激活区的PCR扩增和表达载体pQE30的重组,成功构建了各相应的重组表达系统。经SDS-PAGE凝胶电泳,确认DNA结合区成功表达。在此基础上,对DNA结合区表达系统pQD进行大量表达并通过Ni-NTA亲和层析进行蛋白纯化与定量,获得了mg级的DNA结合区蛋白。以FoxM1c的DNA结合区蛋白为筛选靶标,利用噬菌体随机十二肽库筛选技术,通过“吸附—洗脱—扩增”的循环筛选获得富集噬菌体,经4轮筛选,将最后一轮筛选富集的噬菌体铺板,挑取单克隆噬菌体制备ssDNA并测序获得18条不同序列的十二肽。经分子对接软件MVD进行对接,靶向FoxM1的DNA结合区蛋白的富集噬菌体至少含有以下一种多肽结构序列：第一组：WHL/Q/D/N;第二组：DLY, DLLY, DHYN,DLNY；第三组：SSLWN/E;第四组：HLDY, HLYE, YHLE, LYHDD, YHLEE;第五组FYNL, NYFL;第六组：YPH, YPL, YPS。所述结合肽多肽结构序列分子模拟对接在FoxM1上的结合结构域预测主要是Arg-Arg（R-R, aa:254,256）和Glu-Thr-Ser-Ala-Asn-Gly-Lys（E-T-S-A-N-G-K, aa:298-304）。为进一步的靶向FoxM1c小分子先导肽的发现建立了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题的研究背景和目的
• 1.1.1 课题研究背景
• 1.1.2 课题研究目的
• 1.2 课题的研究内容和意义
• 1.2.1 课题研究内容
• 1.2.2 课题研究意义
• 1.3 论文主要内容和组织
• 第2章 FoxM1c的生物信息分析
• 2.1 引言
• 2.2 实验序列来源
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 多重序列比对ClusterX1.81
• 2.3.2 序列同源性分析（构建进化树TREEVIEW）
• 2.3.3 保守结构域预测、分析以及Blast搜索与新物种的探究
• 2.4 生物信息学分析结果
• 2.4.1 多重序列比对结果
• 2.4.2 进化树构建与评估
• 2.4.3 保守结构域预测、分析以及Blast搜索
• 2.5 小结
• 第3章 人重组FoxM1c表达载体的构建、鉴定及其DNA结合区的诱导表达与纯化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要试剂配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 实验路线
• 3.3.2 人类FoxM1c全长cDNA质粒的检测
• 3.3.3 引物设计
• 3.3.4 PCR扩增
• 3.3.5 PCR产物的回收
• 3.3.6 PCR扩增产物的连接
• 3.3.7 全长重组克隆质粒的提取
• 3.3.8 全长重组克隆质粒双酶切鉴定
• 3.3.9 pQE30载体的酶切
• 3.3.10 载体与外源片段的连接及转化
• 3.3.11 转化克隆的酶切及测序鉴定
• 3.3.12 DNA结合区片段与转录激活区片段的重组载体构建
• 3.3.13 重组质粒工程菌的诱导表达
• 3.3.14 重组质粒工程菌的诱导表达及细胞破碎
• 3.3.15 SDS-PAGE凝胶的制备
• 3.3.16 电泳、染色及脱色
• 3.3.17 使用Ni-NTA分离纯化目的蛋白
• 3.3.18 纯化后目的蛋白电泳检测
• 3.3.19 Ni-NTA回收再生
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 人类FoxM1c全长cDNA质粒的检测
• 3.4.2 全长重组克隆质粒双酶切鉴定
• 3.4.3 pQE30载体的酶切
• 3.4.4 重组表达载体pQ-FoxM1c双酶切
• 3.4.5 DNA结合区片段与转录激活区片段的重组载体构建
• 3.4.6 重组质粒工程菌的诱导表达
• 3.4.7 重组质粒工程菌的诱导表达最佳时间及目的蛋白的纯化的摸索
• 3.4.8 目的蛋白分离纯化
• 3.4.9 目的蛋白定量结果
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 第4章 靶向FoxM1c DNA结合区蛋白的噬菌体随机肽库筛选
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 主要试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 噬菌体结合目的蛋白及亲和力竞争洗脱
• 4.3.2 滴度测定
• 4.3.3 噬菌体扩增
• 4.3.4 ssDNA提取及测序
• 4.3.5 噬菌体亲和力测定
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 噬菌体十二肽筛选及亲和力测定结果
• 4.4.2 结合肽序列测定与分析
• 4.4.3 18条噬菌体结合肽序列的多重序列比对
• 4.5 讨论
• 4.6 结论
• 第5章 筛选肽与FOXM1C的分子对接与模拟
• 5.1 实验方法与结果
• 5.1.1 人类FoxM1c蛋白三级结构的获得
• 5.1.2 分子对接
• 5.1.3 FoxM1c的DNA结合区的分子对接
• 5.2 讨论
• 5.3 小结
• 综述
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 个人简历