论文摘要
Notch信号途径广泛存在于多种生物体内,且进化上高度保守,在胚胎发育、血细胞发育及肿瘤形成等多种病理生理过程中发挥重要作用。Notch信号在造血系统发育中起着十分重要的作用。近来发现,人造血干/祖细胞表面存在Notch受体的表达,而在骨髓基质细胞表面存在多种Notch配体的表达,提示Notch信号途径可能对造血干/祖细胞的自我更新与增殖起到重要作用。有研究表明Notch可以抑制造血干/祖细胞的分化,但促进其增殖。研究还发现,Notch信号途径能使共同淋巴样前体细胞向T细胞方向分化,抑制向B细胞方向的分化;在外周脾脏B细胞发育中,Notch信号激活使其向边缘带B细胞方向分化。此外,Notch信号的失调与血液系统的许多肿瘤相关,Notch信号与T细胞的恶性转化密切相关,Notch在其中起着癌基因的作用。目前体外研究Notch信号对细胞增殖、分化和凋亡的作用多采用Notch配体刺激。Notch配体表达系统分真核表达系统和原核表达系统。真核表达绝大多数是哺乳动物细胞系,如CHO,COS7等,但由于哺乳动物细胞表达系统成本高、难操作、表达水平低,限制其广泛应用。而原核表达系统由于没有翻译后加工修饰系统,表达的真核细胞蛋白质多以包涵体形式表达,复性纯化方法复杂。而毕赤酵母表达系统兼有原核生物和真核生物的某些优点:有翻译后加工修饰系统,酵母能在简单廉价的培养基中快速高密度地繁殖,产量高,成本低,可进行工业化生产。因此在选择Notch配体的表达系统中我们首先选择毕赤酵母,其次是原核表达系统,但需要实现可溶性表达,以利于大规模应用。我们主要进行了如下几方面的研究:1、毕赤酵母表达重组人Delta-like1ext-Fc（hDll1 ext-Fc）蛋白。PCR法扩增hDll1 ext片段,截取已有质粒pET32a-Fc中Fc片段,构建酵母表达载体pPIC9K- hDll1 ext -Fc,和pPIC9K-Fc,经过组氨酸营养缺陷,G418抗生素双重筛选阳性转化子,甲醇诱导表达。2、重组hDll4的原核表达。构建原核表达载体pET32a-hdll4ext-26-217和pET32a-hdll4ext-93-217,转化大肠杆菌BL21,IPTG,30℃低温诱导表达,镍离子螯合珠（Invitrogen ProBondTM）一步纯化上清。3、重组hDll4蛋白生物学功能的检测。通过报告基因实验检测重组hDll4蛋白的生物学活性。结论:实现了hDll1 ext-Fc和人IgG1 Fc片段的在毕赤酵母中的表达;25℃低温诱导实现重组hDll4（His- hdll4ext -93-217）的可溶性表达及纯化;通过报告基因实验验证了重组hDll4（His- hdll4ext -93-217）蛋白的生物学活性。
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相关论文文献
- [1].上调Delta-Like1基因可增强小细胞肺癌化疗敏感性[J]. 中国肺癌杂志 2013(06)
- [2].人Delta-like1~(ext)-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2008(05)
- [3].Notch配体Delta-like 1对小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞分化和抗原呈递功能的影响[J]. 中国实验血液学杂志 2010(03)
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