透明颤菌血红蛋白在产聚γ-谷氨酸地衣芽胞杆菌WX-02中的表达

论文摘要

聚γ-谷氨酸（polyγ-glutamic acid;γ-PGA）是一种应用前景良好的生物高分子材料。地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）WX-02是γ-PGA的产生菌,其发酵液由于较粘稠而导致溶氧很差,溶氧成为γ-PGA产量提高的限制性因素之一。透明颤菌血红蛋白（VHb）是一种来源于原核生物的氧结合蛋白。本研究旨在B.licheniformisWX-02中表达透明颤菌血红蛋白基因（vgb）来改善其发酵过程中氧的利用效率,进而改善菌体生长,提高产量。本研究构建了能整合于芽胞杆菌染色体上的表达载体pDG1730-vgb,其含有芽胞杆菌α-淀粉酶基因的整合位点,通过Spizizen感受态转化导入B.licheniformisWX-02中,PCR验证表明vgb成功整合到其染色体上;经CO差光光谱分析,重组菌株B.licheniformis M2有VHb表达活性;摇瓶发酵实验结果显示,摇床转速为180r/min,发酵36 h的条件下,250 mL三角瓶中发酵液装液量为50 mL时,M2的生物量和γ-PGA产量分别为4.5 g/L和27.71 g/L,高于出发菌株WX-02 6.43%和6.74%;装液量为100 mL时,M2发酵的生物量和γ-PGA产量分别为4.17 g/L和26.59g╱L,高于出发菌株WX-02 15.02%和21.7%。vgb的表达促进了菌体和γ-PGA产量的增长,产物比生物量的增长明显,促进效果随着供氧条件的降低而增加。3 L发酵罐分批发酵结果显示,搅拌转速为600 r/min,通气量为2 L/min时,M2的生物量(OD600)达到7.39,比出发菌株WX-02提高了25.5%,γ-PGA产量达到33.5g╱L,比WX-02提高了20%,进一步证实VHb蛋白的表达对γ-PGA产量和菌体生长的促进作用。整合载体pDG1730-vgb在高产γ-PGA的枯草芽胞杆菌W003中的整合表达已有初步结果,本研究还构建了另一个整合载体psacB-vgb,含有枯草芽胞杆菌果聚糖酶基因（sacB）的整合位点,其在高产γ-PGA的枯草芽胞杆菌W003中的整合表达有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 聚γ-谷氨酸概述
• 1.1.1 聚γ-谷氨酸的结构及理化性质
• 1.1.2 聚γ-谷氨酸的应用
• 1.2 聚γ-谷氨酸的生物合成
• 1.2.1 合成聚γ-谷氨酸的微生物
• 1.2.2 合成聚γ-谷氨酸相关的酶和基因
• 1.2.3 溶氧在芽胞杆菌发酵生产聚γ-谷氨酸中的作用
• 1.3 外源基因在芽胞杆菌中的表达
• 1.4 透明颤菌血红蛋白及其研究应用进展
• 1.4.1 透明颤菌血红蛋白简介
• 1.4.2 VHb的结构与特性
• 1.4.3 VHb的作用机制
• 1.4.4 透明颤菌血红蛋白基因的克隆与表达
• 1.4.5 VHb在芽胞杆菌中的应用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 PCR引物
• 2.1.3 培养基、培养温度及抗生素使用浓度
• 2.1.4 工具酶及试剂
• 2.1.5 各种抽提液
• 2.1.6 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 核酸水平操作
• 2.2.1.1 DNA的体外重组操作
• 2.2.1.2 大肠杆菌质粒的小量抽提制备
• 2.2.1.3 芽胞杆菌总DNA的小量抽提
• 2.2.1.4 DNA的回收及纯化
• 2.2.1.5 PCR扩增
• 2.2.2 重组质粒转化
• 2.2.2.1 大肠杆菌感受态制备及常规转化
• 2.2.2.2 枯草芽胞杆菌的电转化
• 2.2.2.3 枯草芽胞杆菌的质粒消除
• 2.2.2.4 地衣芽胞杆菌的Spizizen感受态转化
• 2.2.2.5 大肠杆菌转化子的快检
• 2.2.3 CO差光光谱法检测血红蛋白表达
• 2.2.3.1 CO的制备
• 2.2.3.2 样品处理与扫描
• 2.2.4 摇瓶发酵培养条件
• 2.2.5 发酵罐分批发酵培养条件
• 2.2.6 生物量测定
• 2.2.7 聚γ-谷氨酸含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 血红蛋白基因在地衣芽胞杆菌中的表达
• 3.1.1 整合质粒pDG1730-vgb的构建
• 3.1.2 地衣芽胞杆菌VHb基因整合菌株的筛选
• 3.1.3 CO差光光谱法检测VHb在地衣芽胞杆菌中的表达
• 3.1.4 地衣芽胞杆菌M2与WX-02的摇瓶发酵
• 3.1.5 地衣芽胞杆菌M2与WX-02的发酵罐分批发酵
• 3.2 血红蛋白基因在枯草芽胞杆菌中的表达
• 3.2.1 整合载体psacB-vgb的构建
• 3.2.2 枯草芽胞杆菌W003的电转化
• 3.2.3 枯草芽胞杆菌W003的质粒消除
• 3.2.4 整合质粒pDG1730-vgb在W003中的整合表达
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢