论文摘要
微囊藻毒素（Microcystins, MCs）是由水华蓝藻产生的一类多肽化合物,现已发现80多种MCs, MC-LR是研究较深入的一种。在关于MCs对生殖系统的毒性作用研究中,多涉及生殖器官、精子质量和相关激素,而关于细胞分子水平的机制研究报道尚少。目的本研究利用体外培养的大鼠睾丸支持细胞为模型研究MC-LR对生殖细胞活性的影响及其诱导支持细胞的凋亡,同时检测凋亡相关基因P53、bax和bcl-2mRNA及蛋白水平的表达,从基因及蛋白水平阐述MC-LR对生殖细胞的凋亡的调控作用。方法1.从未成年雄性SD大鼠睾丸分离纯化睾丸支持细胞,建立原代培养细的胞模型。2.用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）和中性红（neutral red, NR）实验检测MC-LR对支持细胞活性的影响。3. Hoechst荧光染色法检测MC-LR诱导的凋亡睾丸支持细胞。4.反转录聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）法检测MC-LR染毒后细胞中凋亡相关基因p53、bcl-2、bax mRNA水平的表达情况。5. Western blot法检测不同剂量MC-LR染毒不同时间对支持细胞凋亡相关蛋白P53、Bcl-2、Bax的影响。6. Caspase-3底物切除法检测MC-LR对细胞中caspase-3的活性改变。结果1.低剂量MC-LR （0.02～1μg/ml）染毒睾丸支持细胞24h和48h后,MTT和NR检测结果显示细胞活性升高。高剂量MC-LR（10μg/ml和20μg/ml）染毒24h和48h细胞活性显著降低（P<0.05）。2. Hoechst荧光染色结果：随着MC-LR剂量的增高诱导的凋亡细胞增多。3. RT-PCR结果：支持细胞暴露MC-LR 24h,10μg/ml剂量组中p53 mRNA相对表达量与对照组相比明显升高（P<0.05）。1μg/ml剂量组bcl-2 mRNA相对表达量升高（P0.05）,1Oμg/ml组表达量明显降低（P<0.05）。bax mRNA在10μg/ml剂量组细胞中相对表达明显升高且差异有统计学意义（P<0.05）；暴露48h后各目的基因mRNA相对表达量与暴露24h时的趋势相同,但其10μg/ml组与对照组相比表达量的变化更明显且差异均有统计学意义（P0.05）。4. Western blot结果：睾丸支持细胞暴露于MC-LR 24h,与对照相比1μg/ml剂量组P53蛋白相对表达量升高且差异有统计学意义（P0.05）,Bax和Bcl-2蛋白相对表达量改变不明显。10μg/ml剂量组P53和Bax蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）,Bcl-2相对表达量显著降低（P0.05）。MC-LR作用支持细胞48h后,1μg/ml剂量组P53蛋白表达量升高但差异无统计学意义,Bax表达量显著降低（P<0.05）,Bcl-2表达量则显著升高（P<0.05）。10μg/ml剂量组P53和Bax相对表达量显著升高（P<0.05）,Bcl-2表达量显著降低（P<0.05）。5. Caspase-3检测结果：支持细胞染毒MC-LR 24h和48h,与对照组相比1μg/ml剂量组细胞中caspase-3活性变化不明显；10μg/ml剂量组细胞中caspase-3活性明显升高（P<0.05）。结论1.低剂量MC-LR对睾丸支持细胞具有刺激效应,使细胞活性增强；高剂量MC-LR对睾丸支持细胞有抑制效应,使细胞活性降低。2. MC-LR能诱导睾丸支持细胞发生凋亡。3.凋亡相关基因p53,bcl-2,bax, caspase-3在MC-LR诱导睾丸支持细胞的凋亡中起调控作用。