山羊卵母细胞核质成熟同步化研究

论文摘要

卵母细胞体外成熟培养过程中,由于脱离了在体状态下的核成熟抑制机制,而出现细胞核与细胞质成熟的明显不同步性,表现为细胞核首先完成成熟发育,而细胞质成熟则相对滞后。由于卵母细胞核成熟进程影响细胞质的成熟,而细胞质成熟对细胞核成熟又具有促进作用,只有当核质成熟发育同步进行时,卵母细胞才具备受精和受精卵继续发育的能力。周期依赖性蛋白激酶（roscovitine, ROS）为卵母细胞核成熟抑制剂,能可逆性、竞争性地抑制ATP与P34cdc2的结合,阻止cdc2激酶的正常磷酸化过程,从而抑制成熟促进因子（MPF）的激活,延缓卵母细胞核的成熟过程,使体外成熟培养的卵母细胞达到核质成熟时间接近一致。本研究以山羊卵母细胞为研究对象,在卵母细胞成熟培养液中添加梯度浓度的ROS,对山羊卵母细胞进行不同时间的全程核成熟抑制培养（8 h, 16 h, 24 h）,并进行卵母细胞阶段性核成熟抑制培养（8 h, 16 h）和抑制后常规培养（16 h, 8 h）。在此基础上,按照筛选的阶段性抑制培养方案进行卵母细胞培养和培养后卵母细胞孤雌激活及孤雌胚胎体外培养,根据孤雌胚胎体外发育能力,确定利用ROS进行山羊卵母细胞核质成熟同步化培养的方案。研究结果如下:1.常规体外成熟培养条件下卵母细胞核成熟时程山羊卵母细胞在常规体外成熟培养过程中,24 h以内随着培养时间的延长第一极体排出率逐渐增加,培养至24 h时第一极体的排出率最高（67.13±3.10%）,继续培养到26 h28 h时,随着培养时间的延长第一极体的排出率呈下降趋势。2.卵母细胞全程核成熟抑制培养在卵母细胞成熟培养液中分别添加不同浓度的核成熟抑制剂ROS,对山羊卵母细胞分别进行8, 16 h和24 h全程核成熟抑制培养。结果表明,核成熟抑制培养8 h时,核成熟抑制组和对照组卵母细胞核成熟率均较低,说明此时卵母细胞尚未进入核成熟发育进程。核成熟培养16 h时,10, 20μmol/L和40μmol/L ROS添加组卵母细胞核成熟率与对照组差异不显著（P>0.05）;80, 120, 160μmol/L和200μmol/LROS添加组核成熟率均显著低于对照组（P<0.05）。核成熟抑制培养24 h时,10μmol/L和20μmol/L ROS添加组卵母细胞核成熟率与对照组差异不显著（P>0.05）,ROS添加浓度≥40μmol/L时,卵母细胞核成熟率均显著低于对照组（P<0.05）,并表现剂量-效应关系。3.卵母细胞阶段性核成熟抑制培养在添加不同浓度ROS的成熟培养液中,分别对卵母细胞进行核成熟抑制培养16 h后转入常规培养8 h（16 h+8 h）或抑制培养8 h后转入常规培养16 h （8 h+16 h）,并以常规培养24 h作为对照组。结果表明,ROS对山羊卵母细胞的核成熟抑制作用具有时间-效应关系和浓度-效应关系。4.适宜核成熟抑制培养条件下卵母细胞核成熟时程卵母细胞全程核成熟抑制培养和阶段性核成熟抑制培养结果初步证明,在成熟培养液中添加40μmol/L核成熟抑制剂ROS,在核成熟抑制培养8 h后转入常规培养至24 h为卵母细胞核质成熟同步化的适宜培养方案。进一步利用该培养方案进行卵母细胞核成熟抑制培养,验证核成熟抑制培养效果并分析核成熟时程。结果表明,在成熟培养液中添加40μmol/L核成熟抑制剂ROS进行山羊卵母细胞核成熟抑制培养8 h后转入常规成熟培养,在成熟培养的16 h以内,阶段性核成熟抑制培养组（8 h+常规成熟培养）与常规成熟培养组之间第一极体排出率差异不显著（P>0.05）;在成熟培养的18, 20 h和22 h,阶段性核成熟抑制培养组第一极体排出率均显著低于培养相同时间的对照组;在培养的24 h时,阶段性核成熟抑制培养组第一极体排出率（61.01±5.98%）与对照组（67.13±3.10）接近（P>0.05）,说明成熟液中添加40μmol/L ROS进行核成熟抑制培养8 h后转入常规成熟培养,可有效延迟在常规成熟培养条件下培养18 h～22 h时完成核成熟分裂的卵母细胞的减数分裂恢复,从而使这部分卵母细胞的核成熟分裂延迟到接近24 h时完成。5.不同浓度核成熟抑制培养条件下成熟卵母细胞孤雌激活与孤雌胚胎体外发育当成熟培养液中添加不同浓度的核成熟抑制剂ROS抑制培养山羊卵母细胞8 h后转入常规成熟培养至24 h,40μmol/LROS组孤雌激活胚胎的卵裂率和4-8细胞胚率与对照组均无显著性差异,桑椹胚率（69.33±1.83%）和囊胚率（41.33±4.43%）高于对照组（65.19±2.70%、33.09±3.54%）,其余各组孤雌激活胚的整体发育能力低于对照组,没有囊胚形成。孤雌激活胚的培养结果表明,成熟培养液中添加40μmol/LROS核抑制剂抑制培养山羊卵母细胞8 h后,转入常规成熟培养至24 h,可以提高孤雌激活胚胎的体外发育能力。综上所述,成熟培养液中添加40μmol/L核成熟抑制剂ROS抑制培养山羊卵母细胞8 h后再转入常规成熟培养至24 h为山羊卵母细胞体外核质成熟同步化培养的最适方案;此方案可以有效抑制核成熟卵母细胞的减数分裂提前恢复,达到培养24 h核质同步成熟,提高体外培养卵母细胞质量的目的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 综述部分
• 第一章 山羊卵母细胞体外核质成熟同步化研究进展
• 1.1 卵母细胞的体外成熟培养
• 1.1.1 卵母细胞成熟机制
• 1.1.2 卵母细胞的发育能力
• 1.2 影响卵母细胞体外成熟的因素
• 1.2.1 卵母细胞的来源
• 1.2.2 体外培养条件
• 1.2.3 颗粒细胞与卵丘细胞
• 1.2.4 血清、激素和卵泡液
• 1.2.5 核质协调性
• 1.3 卵母细胞的成熟调控
• 1.3.1 成熟促进因子
• 1.3.2 蛋白激酶A 和环化核苷酸
• 1.3.3 蛋白质磷酸化抑制剂
• 1.3.4 成熟抑制因子
• 1.3.5 细胞生长抑制因子
• 1.3.6 促性腺激素和细胞生长因子
• 1.3.7 卵母细胞与卵泡的关系
• 1.3.8 核质成熟及其关系
• 1.4 卵母细胞孤雌激活
• 1.4.1 卵母细胞孤雌激活的方法
• 1.4.2 孤雌胚的发育
• 1.4.3 活化的主要途径
• 试验研究
• 第二章 山羊卵母细胞核质成熟同步化研究
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 山羊卵巢
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 主要操作液和培养液
• 2.2 方法
• 2.2.1 卵母细胞的采集
• 2.2.2 卵母细胞的体外成熟培养
• 2.2.3 数据统计分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 常规成熟培养不同时间山羊卵母细胞的核成熟情况
• 2.3.2 卵母细胞全程核成熟抑制培养24 h 的培养结果
• 2.3.3 卵母细胞全程核成熟抑制培养16 h 的培养结果
• 2.3.4 卵母细胞全程核成熟抑制培养8 h 的培养结果
• 2.3.5 卵母细胞核成熟抑制培养8 h 和16 h 并转入常规培养至24 h 的培养结果
• 2.3.6 山羊卵母细胞核成熟抑制培养中核成熟时程
• 2.4 讨论
• 2.4.1 山羊卵母细胞常规体外成熟培养条件下的成熟发育
• 2.4.2 ROS 添加浓度对山羊卵母细胞体外成熟的影响
• 2.4.3 ROS 抑制培养时间对山羊卵母细胞体外成熟的影响
• 2.5 小结
• 第三章 核质同步成熟山羊卵母细胞孤雌激活及孤雌胚培养
• 3.1 材料
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂和仪器设备
• 3.1.3 主要操作液和培养液
• 3.2 方法
• 3.2.1 ROS 抑制培养24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育
• 3.2.2 ROS 抑制培养16 小时转入常规培养至24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育
• 3.2.3 ROS 抑制培养8 小时转入常规培养至24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育
• 3.2.4 核成熟抑制培养的卵母细胞孤雌激活
• 3.2.5 激活孤雌胚的体外培养
• 3.2.6 数据统计分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 ROS 抑制培养24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育结果
• 3.3.2 ROS 抑制培养16 小时转入常规培养至24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育结果
• 3.3.3 ROS 抑制培养8 小时转入常规培养至24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 高浓度ROS 影响胚胎的发育能力
• 3.4.2 低浓度ROS 对山羊孤雌激活胚体外发育的影响
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介