论文摘要
背景：肺纤维化疾病是一种进行间质纤维沉积性疾病,严重影响着全球数百位人的健康。肺纤维化的病理生理特点是肺泡的损伤、肺间质中炎性细胞的浸润,成纤维细胞的激活和增殖,细胞外基质的沉淀引起肺结构的破坏,最终导致严重的呼吸困难。其中成纤维细胞的激活、大量增殖及分泌细胞外基质,合成细胞因子,启动炎症反应,且调节II型肺泡上皮细胞和其他一些细胞的功能,被认为的肺纤维化发生发展的中心环节。血管紧张素Ⅱ （AngiotensinⅡ, AngⅡ）是被证实的能够促进炎症细胞的聚集,炎症细胞分泌大量炎症因子及促纤维化因子作用于成纤维细胞,并且AngⅡ能够直接明显激活成纤维细胞,促使成纤维细胞的DNA合成表达增多,是促进其增殖及分泌细胞外基质的重要因素。许多研究证明在动物肺纤维化模型及肺纤维化病人的肺组织中肺组织局部的肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）处于过度激活状态,血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ, AngⅡ）大量生成,其特异性受体1（AngiotensinⅡ type 1 receptor,AT1R）表达明显增加。过度激活的RAS损伤肺泡上皮细胞,促进肺泡上皮细胞凋亡,诱导成纤维细胞的迁移及增殖,另一方面,RAS直接激活肺成纤维细胞及促进其增殖、分化、分泌细胞外基质,使肺间质大量基质沉积,促进肺纤维化的发生发展。因此,下调或者阻断RAS有可能成为治疗肺纤维化的有效手段。在动物实验中运用血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI）和血管紧张素受体阻断剂（angiotensin receptor blocker,ARB）能够减轻博莱霉素诱导的肺纤维化。在临床实验组中,也证明ARB能够改善肺纤维化患者的肺功能,但ACEI及ARB减轻肺纤维化的效果不是非常满意。因此,寻找更有效的下调或者阻断RAS的药物也许能够成为治疗肺纤维化的有效手段。血管紧张素转化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）/血管紧张素（1-7） （Angiotensin （1-7）,Ang-（1-7））/Mas轴是最近发现的RAS的新组分,表现为对抗ACE/AngⅡ/AT1R的作用。ACE2是一种可以将八肽AngII降解为七肽Ang-（1-7）, Ang-（1-7）可以对抗AngII的作用,即抗增殖、调节水电解质平衡、舒张血管、降低血压等作用。在大鼠肺组织中过表达ACE2或者Ang-（1-7）可以抑制心脏重建、肝纤维、肾纤维化、保护大脑功能,并且在动物实验中可减轻BLM诱导的大鼠肺纤维化。那么Ang-（1-7）是如何减轻大鼠肺纤维化的,是否与阻断AngⅡ有关及具体分子机制是什么?进一步的实验证明,AngⅡ促肺纤维化的机制可能是与AT1R结合后,活化的ATlR可以激活下游的MAPKK,进一步促进细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）磷酸化。磷酸化的ERK （p-ERK）可促进Iκ-K （inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase）磷酸化,p-Iκ-K可以降解NF-κB （Nuclear factor kappa-B）的抑制蛋白IκB （inhibitor of nuclear factor kappa-B）,使NF-κB游离并发生核转位,调控促进纤维化相关因子基因的转录和蛋白翻译,如转换生长因子β1（transforming growth factor, TGF-β1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）等。促纤维化相关因子可促进成纤维细胞增殖、分化成肌成纤维细胞并分泌大量细胞外基质。那么Ang-（1-7）是否可以通过阻断Ang1I激活ERK/NF-κB来抑制肺纤维化的发生发展呢?方法：体内试验：将24只体重250±20g的雄性wistar大鼠随机分成四组,每组6只, 即control组,BLM组（气管内滴入博莱霉素（bleomycin, BLM）,5mg/kg）,BLM+Ang-（1-7）组（气管内滴入博莱霉素的同时与皮下持续泵入Ang-（1-7）,25 ug·kg-1·h-1）, BLM+AngⅡ组（气管内滴入博莱霉素的同时与皮下持续泵入AngⅡ,25 ug·kg-1·h-1）四周后取右下肺组织行病理切片HE及Massion染色,组织羟脯氨酸（HYP）测定。检测ACE2、ACE、Mas、 AT1R、TNF-α和血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen Activator Inhibitor 1, PAI-1） mRNA的变化。检测ACE2、ACE、CTGF、α-SMA及α-collagen Ⅰ蛋白的变化。体外试验：用组织贴壁法分离培养肺成纤维细胞（fibroblast）,采用第三至五代细胞进行实验。设置control组、Ang1I组（10-7M）、Ang-（1-7）组（10-7M）、AngⅡ+Ang-（1-7）组、AngⅡ+irbesartan组（irbesartan预处理细胞1小时后,加入AngⅡ）、 AngⅡ+Ang-（1-7）+A-779组（A779 10-6M干预1小时后,予Ang-（1-7） AngⅡ 10-7M刺激）、AngⅡ+PD98059组（PD98059预处理细胞1小时后,加入AngⅡ）、AngⅡ+BAY117082组（BAY117092预处理细胞1小时后,加入Ang1I）。利用QRT-PCR检测TNF-α及PAI-1 mRNA变化、WB检测ERK及Iκ-K磷酸化水平、IκB、NF-κB、CTGF、α-SMA及a-collagen I蛋白表达情况。结果：体内试验结果1.Ang-（1-7）减轻了BLM诱导的大鼠肺纤维化。大鼠肺组织病理切片HE染色显示,control组大鼠肺脏大致正常,镜下未见炎症细胞浸润和肺实质胶原沉积。BLM组镜下可见肺泡结构破坏,肺泡间隔仍明显增厚,炎性细胞浸润,成纤维细胞大量增生,纤维组织呈瘢痕改变,斑片状分布,但外周肺实质炎症有更进一步的吸收。BLM+Ang-（1-7）组镜下可见肺泡结构破坏程度较BLM组明显较少,肺泡间隔炎症细胞浸润、成纤维细胞增生及细胞外基质沉积程度较BLM明显减轻。BLM组大鼠肺纤维化Ashcroft score评分较control组明显升高,BLM+Ang-（1-7）组肺纤维化Ashcroft score评分叫BLM组明显降低。Massion三色染色见,control组大鼠肺泡间隔有少量染成蓝色的胶原纤维,BLM组肺泡间隔大量染成蓝色的胶原纤维,而Ang-（1-7）治疗组肺泡间隔染成蓝色的胶原纤维胶BLM组明显减少。肺组织羟脯氨酸（HYP）含量检测示：control组为0.5952±0.1528 mg/g; BLM组为3.6905±0.1753 mg/g; BLM+Ang-（1-7）组较BLM明显减少为2.1429±.2944mg/g。促纤维化因子TNF-α mRNA及CTGF蛋白、抑制胶原降解酶PAI-1mRNA表达水平检测示,BLM组较control组明显升高,而Ang-（1-7）治疗组较BLM组减少。细胞外基质主要成份α-SMA及α-collagen I蛋白表达情况示：BLM组较control组明显升高,而Ang-（1-7）治疗组较BLM组减少。AngⅡ加重了BLM诱导的肺纤维化。2.Ang-（1-7）抑制肺纤维化大鼠肺组织中ERK的磷酸化及NF-κB的激活检测总蛋白中磷酸化的ERK和总ERK的比,结果示纤维化大鼠肺组织中比值明显升高,AngⅡ又明显提升了这个比值；而Ang-（1-7）减少了ERK的磷酸化水平。组织胞浆蛋白检测IκK磷酸化水平,发现纤维化大鼠肺组织中IκK磷酸水平明显升高,AngⅡ对IκK磷酸水平的促进作用不是很明显,Ang-（1-7）减少了BLM诱导升高的IκK磷酸化水平。IkB蛋白在BLM组及BLM+AngⅡ大鼠肺组织中降解明显,Ang-（1-7）抑制了IkB的降解。核蛋白中NF-κB蛋白水平在纤维化大鼠模型中升高明显,并且BLM+AngⅡ组水平更高,但Ang-（1-7）明显的减少了核蛋白中NF-κB蛋白水平。3.Ang-（1-7）抑制ACE/AngⅡ/AT1R轴的激活,促进了ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴激活。肺组织局部RAS检测,BLM组RAS主要成份ACE蛋白及aT1R mRNA较正常组明显升高,而ACE2蛋白及Mas mRNA的水平较正常组有所升高,升高水平不及ACE及AT1R; BLM+Ang-（1-7）组ACE蛋白及AT1R mRNA表达水平较BLM组明显下降,ACE2蛋白及Mas mRNA的表达水平较BLM组明显升高。体外实验结果1.Ang-（1-7）抑制了AngⅡ激活的ERK/NF-κB信号通路。AngⅡ刺激细胞30min后提取细胞蛋白,WB检测p-ERK水平较control组明显升高；Ang-（1-7）刺激细胞后,p-ERK水平较control组明显升高,但较AngⅡ组低；AngⅡ+Ang-（1-7）组、AngⅡ+irbesartan组、AngⅡ+PD98059组较AngⅡ组明显较少；而AngⅡ+Ang-（1-7）+A-779组较AngⅡ+Ang-（1-7）明显升高。AngⅡ刺激细胞,免疫荧光检测核蛋白NF-κB核转位情况,发现AngⅡ刺激细胞1小时后NF-κB核转位明显,4个小时后NF-κB由核转移出胞浆；Ang-（1-7）单独刺激也发现有少量的NF-κB核转位;而Ang-（1-7）和irbesartan明显抑制AngⅡ诱导的NF-κB核转位的核转位；A-779也明显了阻断了Ang-（1-7）对AngⅡ诱导NF-κB核转位的抑制作用。同时,检测了细胞核蛋白NF-κB表达变化,AngⅡ较正常组明显升高,胞浆蛋白中IκKα/P磷酸化水平也较control组明显升高,而IκB-α蛋白表达水平较正常组明显下降；Ang-（1-7）也有轻微的促进核蛋白中NF-κB的增多,IκKα/β磷酸化水平抑制IKB-α蛋白表达;而Ang-（1-7）、irbesartan、PD98059及BAY117082具有明显的阻断AngⅡ激活NF-κB信号通路；A-779也明显了抑制了Ang-（1-7）对AngⅡ的抑制作用。进一步检测了NF-κB信号通路下游炎症因子TNF-α mRNA及促纤维化因子CTGF蛋白表达的情况,AngⅡ及Ang-（1-7）促进NF-κB核转位的同时,NF-κB激活了TNF-α基因的转录,使TNF-α mRNA及CTGF蛋白表达增多；但Ang-（1-7）的促进作用较AngⅡ组明显减弱；Ang-（1-7）、irbesartan、PD98059及BAY117082具有明显的抑制AngⅡ对TNF-α mRNA及CTGF蛋白表达的促进作用；A-779也明显了抑制了Ang-（1-7）对AngⅡ的抑制作用。2.Ang-（1-7）抑制了AngⅡ诱导的α-SMA及α-collagen Ⅰ表达。我们检测了AngⅡ和Ang-（1-7）对细胞外基质的主要蛋白α-SMA及α-collagen Ⅰ表达的影响及Ang-（1-7）、irbesartan、PD98059及BAY117082对AngⅡ的作用,发现AngⅡ和Ang-（1-7）促进了α-SMA及α-collagen Ⅰ表达,并且AngⅡ的促进作用明显高于Ang-（1-7）; Ang-（1-7）、irbesartan、PD98059及BAY117082减少了AngⅡ诱导的α-SMA及α-collagen Ⅰ表达。结论：1.Ang-（1-7）能够明显减少BLM诱导大肺纤维化,其机制可能与抑制ACE/AngⅡ/AT1R轴的激活,阻断AngⅡ的作用及上调ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴激活有关。2.Ang-（1-7）通过Mas受体抑制了AngⅡ对ERK/NF-κB激活作用,减少了成纤维细胞分泌细胞外基质。3.Ang-（1-7）对成纤维细胞有双重作用：单纯Ang-（1-7）可促进成纤维细胞合成及分泌细胞外基质；另一方面,Ang-（1-7）可以抑制AngⅡ促纤维化的作用。
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