前列腺癌小鼠模型差异表达基因的筛选及TRIM59基因功能的初步研究

论文摘要

前列腺癌是男性特有的肿瘤,也是全球男性常见的恶性肿瘤疾病,死亡率高居第二位。目前,前列腺癌的发病率呈逐年上升趋势。前列腺癌发展过程漫长且隐匿,临床标本难以获得。因此,常用模拟前列腺癌发展的细胞或动物模型开展前列腺癌基础研究。利用前列腺分泌蛋白94（PSP94）启动子建立的基因敲入前列腺癌小鼠模型（KIMAP）,显示与人类相近的肿瘤特征。本研究以KIMAP前列腺癌小鼠模型为研究对象,主要包括以下内容:（1）利用基因芯片对不同生长时期（20周龄和60周龄）的小鼠进行差异表达基因筛选,筛选高上调表达未知功能基因;并结合反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时定量PCR方法对筛选出来的高上调表达未知功能基因进行验证;（2）利用RT-PCR技术对筛选出的一个小鼠高上调表达未知功能基因编码区序列进行克隆,并利用生物信息学方法分析其蛋白质结构;（3）构建该未知功能基因的原核表达载体,利用亲和层析技术纯化重组蛋白,Western-blot技术检测重组蛋白;（4）利用纯化后的重组蛋白免疫家兔,制备该未知功能基因的多克隆抗体;（5）利用获得的多克隆抗体进行该基因功能研究。获得的主要研究结果如下:（1）小鼠前列腺癌高上调表达基因的筛选。本研究成功进行前列腺癌模型小鼠基因芯片检测,结果表明在20周龄的模型小鼠中发现上调基因491个（大于等于正常小鼠的2倍）,60周龄的模型小鼠中发现上调基因442个（大于等于正常小鼠的2倍）。本研究选择上调10倍以上的基因进行分析。前列腺组织表达上调10倍以上的基因有72个,其中67个为已知功能基因,5个为未知功能基因。对5个未知功能基因进行RT-PCR和实时荧光PCR方法验证,结果与基因芯片结果相一致。（2）小鼠未知功能基因TRIM59的编码区克隆及生物信息学分析。利用RT-PCR技术克隆小鼠TRIM59基因的编码区序列,其编码区长度为1212 bp。将小鼠TRIM59（NM025863）与人TRIM59（NM173084）、鸡TRIM59（NM173084）的核苷酸和氨基酸进行同源性分析,核苷酸序列同源性分别为85 %和72 %;氨基酸序列同源性分别为86 %和75 %。对TRIM59的氨基酸结构、潜在功能位点等进行分析,预测结果表明TRIM59第1059位氨基酸为RING结构域、第92134位氨基酸为B-box结构域、第329348位氨基酸为跨膜结构域;1328位氨基酸残基编码膜外蛋白,349403位氨基酸残基编码膜内蛋白;通过磷酸化位点分析发现该蛋白具有潜在的蛋白磷酸化修饰。（3）小鼠TRIM59基因的原核表达。本研究特别选取TRIM59编码第277～403位的C末端126位氨基酸（cDNA序列的9611338位碱基）作为抗原区进行克隆。将TRIM59基因的部分编码区插入pGEX-2T载体中成功构建原核表达载体;结果在大肠杆菌BL21中通过IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导,成功表达带谷胱甘肽转移酶（GST）标签的45 kDa左右的TRIM59重组蛋白,且经过Western Blotting检测该蛋白表达正确。通过收集纯化后的GST-TRIM59重组蛋白,为制备TRIM59多克隆抗体奠定重要的基础。（4）TRIM59兔抗鼠多克隆抗体的制备与抗体的应用。利用之前制备纯化的GST-TRIM59重组蛋白,免疫家兔成功地制备兔抗鼠TRIM59多克隆抗体,经鉴定具有良好的免疫学活性,能够用于试验研究。利用获得的TRIM59抗体进行荧光免疫试验发现TRIM59主要定位于NIH3T3的细胞胞浆执行其生物功能。Western blotting印迹和免疫组化染色显示TRIM59在前列腺癌组织中的表达明显高于正常组织,验证小鼠前列腺癌芯片的关于TRIM59的结果,也为TRIM59作为前列腺癌诊断标志物提供参考。（5）TRIM59的RING结构域功能研究。试验结果表明,突变后以及缺失RING结构域的TRIM59在体内外试验中,均无法与泛素形成多聚肽链的结构,只有正常TRIM59 （与E2结合酶UbcH5a或UbcH5c共同作用）具有与泛素形成多聚肽链结构的能力,说明RING结构域是TRIM59具有泛素连接酶活性的重要功能域,半胱氨酸（Cys）对RING结构的生物学功能的保证具有重要作用。本研究通过对前列腺癌模型小鼠基因芯片结果的筛选,研究与前列腺癌相关未知基因的功能,为寻找新的前列腺癌治疗靶点和诊断标志物奠定一定的理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 前列腺癌的小鼠模型
• 1.2.1 前列腺癌动物模型种类
• 1.2.2 转基因小鼠模型的分类
• 1.3 与前列腺癌的相关基因研究进展
• 1.3.1 癌基因
• 1.3.2 抑癌基因
• 1.4 基因芯片技术
• 1.4.1 基因芯片技术原理及步骤
• 1.4.2 基因芯片在肿瘤研究中的应用
• 1.5 生物信息学与新基因功能的预测
• 1.5.1 新基因及其功能的预测
• 1.5.2 蛋白质结构与功能预测及方法
• 第二章 小鼠前列腺癌差异表达基因的筛选
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验样品
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 基因芯片
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA 的提取
• 2.2.2 总RNA 的纯化
• 2.2.3 基因芯片的操作流程
• 2.2.4 基因芯片结果的分析
• 2.2.5 RT-PCR 实验
• 2.2.6 SYBR Green（?） I 实时荧光PCR 检测法
• 2.3 结果
• 2.3.1 总RNA 的制备
• 2.3.2 基因芯片的杂交结果
• 2.3.3 上调表达基因数量
• 2.3.4 上调差异表达基因分析
• 2.3.5 相关候选基因的RT-PCR 检测
• 2.3.6 相关候选基因的实时荧光定量法检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 KIMAP 前列腺癌小鼠模型
• 2.4.2 利用基因芯片技术进行差异表达基因检测
• 2.4.3 芯片结果的验证
• 2.4.4 差异表达基因
• 2.5 小结
• 第三章 小鼠TRIM59 基因的克隆及生物信息学分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 载体和菌株
• 3.1.2 组织样品
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要溶液配制
• 3.1.5 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 总RNA 的提取
• 3.2.2 引物设计与合成
• 3.2.3 RT-PCR
• 3.2.4 PCR 产物的回收
• 3.2.5 连接
• 3.2.6 转化
• 3.2.7 菌落PCR
• 3.2.8 阳性克隆cDNA 片断测序及序列分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 组织中总RNA 的提取及检测
• 3.3.2 小鼠TRIM59 基因编码区的克隆
• 3.3.3 小鼠TRIM59 基因的生物信息学分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 小鼠TRIM59 编码区的克隆及物种间相似比对
• 3.4.2 关于TRIM59 基因的功能分析
• 3.4.3 生物信息学分析
• 3.5 小结
• 第四章 小鼠TRIM59 基因的原核表达
• 4.1 材料
• 4.1.1 载体及宿主菌
• 4.1.2 cDNA 模板
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 克隆载体的构建
• 4.2.3 原核表达载体的构建
• 4.2.4 重组蛋白的诱导表达与纯化
• 4.2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 pMD18-TRIM59 克隆载体的构建
• 4.3.2 pGEX-2T-TRIM59 原核表达载体的构建
• 4.3.3 pGEX-2T-TRIM59 质粒的表达目的蛋白的诱导表达与纯化
• 4.3.4 Western Blotting 检测
• 4.4 讨论
• 4.4.1 表达系统的选择与TRIM59 抗原序列的确定
• 4.4.2 TRIM59 重组蛋白的表达与纯化
• 4.5 小结
• 第五章 TRIM59 兔抗鼠多克隆抗体的制备
• 5.1 材料
• 5.1.1 实验动物
• 5.1.2 抗原蛋白
• 5.1.3 质粒及细胞株
• 5.1.4 主要试剂
• 5.1.5 实验仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 抗原乳化
• 5.2.2 动物接种
• 5.2.3 抗血清的收集
• 5.2.4 抗血清的纯化
• 5.2.5 抗体稀释效价的测定（间接法ELISA）
• 5.2.6 细胞的复苏
• 5.2.7 细胞传代培养
• 5.2.8 细胞转染
• 5.2.9 Western Blotting 检测抗体
• 5.2.10 免疫荧光
• 5.2.11 免疫组织化学染色
• 5.3 结果
• 5.3.1 多克隆抗体的效价鉴定
• 5.3.2 多克隆抗体的Western blotting 检测
• 5.3.3 TRIM59 在NIH3T3 细胞中的定位
• 5.3.4 TRIM59 在前列腺癌组织中的表达
• 5.4 讨论
• 5.4.1 多克隆抗体的制备
• 5.4.2 多克隆抗体的鉴定
• 5.4.3 TRIM59 定位于NIH3T3 细胞胞浆中
• 5.4.4 TRIM59 在前列腺癌组织中的表达
• 5.5 小结
• 第六章 TRIM59 的RING 结构域功能研究
• 6.1 材料
• 6.1.1 质粒和细胞
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 实验仪器
• 6.2 方法
• 6.2.1 引物设计
• 6.2.2 pEBG-TRIM59 点突变载体构建
• 6.2.3 细胞的复苏
• 6.2.4 细胞传代培养
• 6.2.5 细胞转染
• 6.2.6 真核表达的GST 融合蛋白的纯化
• 6.2.7 细胞总蛋白的定量
• 6.2.8 Western Blot 检测
• 6.2.9 GST pull-down 实验
• 6.2.10 体外泛素化修饰实验
• 6.2.11 免疫沉淀实验
• 6.2.12 体内泛素化修饰实验
• 6.3 结果
• 6.3.1 pEBG-TRIM59 点突变载体的构建
• 6.3.2 GST 融合蛋白在细胞293T 中的表达
• 6.3.3 TRIM59 蛋白的体外泛素化修饰
• 6.3.4 TRIM59 只能和特定的泛素结合酶E2 共同催化泛素化反应
• 6.3.5 TRIM59 的RING 结构域具有泛素E3 连接酶活性
• 6.3.6 TRIM59 蛋白的体内泛素化修饰
• 6.4 讨论
• 6.4.1 蛋白质泛素化
• 6.4.2 TRIM59 的泛素连接酶E3 活性
• 6.4.3 RING 结构是TRIM59 具有泛素连接酶E3 活性主要功能区
• 6.4.4 TRIM59 的C13A 点突变引入
• 6.5 小结
• 第七章 结论
• 7.1 主要结论
• 7.2 本研究的创新点
• 7.3 进一步研究内容
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 个人简介