长穗偃麦草中AP2/EREBP类转录因子基因的克隆与功能验证

论文摘要

干旱、盐碱、低温等非生物逆境胁迫对植物的生长发育有重大的影响,是造成农作物减产的直接原因。这些逆境因子会引起植物体内产生一系列生理生化变化以响应外界环境的变化。转录因子是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白,通过它们与顺式元件及其它相关蛋白之间的相互作用,可激活或抑制下游一系列功能基因的转录。植物中的AP2/EREBP类转录因子基因受到干旱、高盐、低温等逆境因子诱导会启动下游一系列抗逆功能基因的表达,对提高植物的综合抗逆性具有重要科学意义和应用价值。本研究利用同源序列克隆方法,结合RACE（ rapid amplification of cDNA ends）和Genome Walking技术,从抗逆性优良的野生十倍体长穗偃麦草（Elytrigia elongata,2n=70）中克隆了AP2/EREBP家族的两个逆境高丰度表达基因的全长cDNA,分别命名为EeAP2-1.1和EeAP2.2。序列分析表明,EeAP2-1.1具有一个1179bp的开放阅读框,编码392个氨基酸残基,含有一个保守的AP2结构域,属于EREBP亚家族中的一个ERF转录因子基因。该基因编码的氨基酸序列与大麦基因HvERF1（GenBank登录号为ADO21119.1）编码的氨基酸序列一致性为77%,与登录号为EAZ09217.1,AAV98700.1,AAM00285.1的水稻基因编码的氨基酸序列一致性分别为76%,76%和73%,与登录号为ABO09809.1的甘蔗基因编码的氨基酸序列一致性为76%。EeAP2.2基因具有一个837bp的开放阅读框,编码278个氨基酸残基,同样含有一个保守的AP2结构域,是AP2大家族的又一个新成员。该基因编码的氨基酸序列与普通小麦AP2家族同源基因TaDREB1和TaDREBW50 （GenBank登录号为AAL01124.1, AAY44604.1）编码的氨基酸具有97%的序列一致性,与登录号为AAY25517.1的大麦基因HvDREB1-a ,登录号为CAG30547.1的高羊茅基因FaDREB2A及登录号为AY064403的水稻OsDREB2.2基因编码的氨基酸序列一致性分别为92%,85%,68%。说明该基因与小麦AP2家族基因的同源性最高。。此外,本研究同时构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有EeAP2.2和EeAP2-1.1基因的植物表达载体pBI121- EeAP2.2和pBI121- EeAP2-1.1。通过农杆菌介导的叶盘浸染法进行了烟草转化,目前已获得了烟草T0代转EeAP2.2基因植株。通过Gus染色证明目的基因在烟草体内获得了表达,通过酵母单杂交试验验证了EeAP2.2基因可以与DREB顺式元件DRE结合,说明其为一DREB类转录因子。EeAP2.2和EeAP2-1.1的抗逆机理及小麦转化试验正在进行中。本研究除从长穗偃麦草中获得了两个AP2/EREBP家族转录因子基因EeAP2.2和EeAP2-1.1的全长cDNA序列外,也提供了一种快速、有效克隆同一家族功能基因的方法。为探讨AP2/EREBP家族基因对植物生长发育、综合抗逆性等方面的作用研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 综述
• 1.1 逆境胁迫对植物的损害
• 1.1.1 干旱胁迫对植物的损害
• 1.1.2 高盐胁迫对植物的损害
• 1.1.3 低温胁迫对植物的损害
• 1.2 逆境胁迫下植物细胞的信号传导
• 1.3 植物AP2/EREBP 转录因子家族
• 1.3.1 转录因子概述
• 1.3.2 植物AP2/EREBP 转录因子家族
• 1.3.3 EREBP 转录因子在植物抗逆中的作用
• 1.3.4 AP2/EREBP 转录因子与植物进化的关系
• 1.4 本研究的内容和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及质粒载体
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 长穗偃麦草cDNA 第一条链获得方法
• 2.2.2 长穗偃麦草基因组DNA 的提取
• 2.2.3 EeAP2.2 基因的克隆
• 2.2.4 EeAP2-1.1 基因的克隆
• 2.2.5 EeAP2.2 基因真核表达载体构建
• 2.2.6 EeAP2-1.1 基因真核表达载体构建
• 2.2.7 烟草的遗传转化
• 2.2.8 酵母单杂交验证EeAP2.2 编码的蛋白与DRE 顺式作用元件的结合
• 2.2.9 茎尖法小麦转EeAP2-1.1 基因
• 2.2.10 EeAP2.2 和EeAP2-1.1 基因编码蛋白的生物信息学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 长穗偃麦草EeAP2.2 基因的克隆
• 3.1.1 长穗偃麦草总RNA 检测
• 3.1.2 EeAP2.2 RT-PCR 扩增结果
• RACE 扩增结果'>3.1.3 EeAP2.2 基因3＇_RACE 扩增结果
• 3.1.4 EeAP2.2 基因 Genome Walking 扩增结果
• 3.1.5 测序结果的分析，拼接及ORF 框的扩增
• 3.2 长穗偃麦草EeAP2-1.1 基因的克隆
• 3.2.1 EeAP2-1.1 基因开放读码框的扩增结果
• RACE 扩增结果'>3.2.2 EeAP2-1.1 基因3＇_RACE 扩增结果
• 3.3 EeAP2.2 基因真核表达载体的构建
• 3.3.1 获得完整目的基因片段的BamHⅠ酶切条件摸索
• 3.3.2 EeAP2.2 真核表达载体的构建及酶切鉴定
• 3.4 EeAP2-1.1 基因真核表达载体的构建
• 3.4.1 获得完整目的基因片段的BamHⅠ酶切条件摸索
• 3.4.2 EeAP2-1.1 真核表达载体的构建及酶切鉴定
• 3.5 EeAP2-1.1 和EeAP2.2 转化农杆菌C58 的阳性克隆鉴定
• 3.6 PCR 检测卡那抗性烟草植株
• 3.7 组织化学法检测GUS 基因的表达
• 3.8 酵母单杂交
• 3.8.1 用于构建AD 融合表达载体的EeAP2.2 基因ORF 框的扩增结果
• 3.8.2 pGAD- EeAP2.2 的构建及鉴定结果
• 3.8.3 酵母转化子的PCR 鉴定
• 3.8.4 EeAP2.2 转录激活作用的验证
• 3.9 茎尖法小麦转EeAP2-1.1 基因
• 3.10 EeAP2.2 及EeAP2-1.1 基因生物信息学分析
• 3.10.1 EeAP2.2 编码的氨基酸序列与其他植物氨基酸序列同源性的比较
• 3.10.2 EeAP2-1.1 编码的氨基酸序列与其他植物氨基酸序列同源性的比较
• 4 讨论
• 4.1 关于基因克隆
• 4.2 关于部分双酶切
• 4.3 关于酵母单杂交
• 4.4 关于长穗偃麦草AP2/EREBP 家族的转录因子
• 4.5 关于茎尖法小麦转基因
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表论文
• 作者简历
• 致谢
• 附录I：试验中载体构建流程图