利用密码子偏好性对大肠杆菌异源蛋白进行可控表达

论文摘要

大肠杆菌由于其遗传背景清楚,表达周期短,有大量的可用表达载体,能够进行大规模的发酵培养,而成为人们克隆和表达外源蛋白的首选。然而,大肠杆菌在作为异源蛋白的表达系统时,由于翻译速度太快,表达量过高,容易形成包涵体,这往往会带来非常严重的负面效应；并且,在大肠杆菌代谢工程研究中,需要将代谢途径中的中间酶的表达水平控制在一定范围内,实现整个途径多基因的联合协同表达。尽管,目前人们已经有很多成熟的调控基因表达的系统,但是能达到代谢工程要求的精确调控系统还比较少。本研究利用稀有密码子,通过降低翻译速度来降低蛋白表达量,筛选得到一套可按不同梯度下调蛋白表达量的密码子调控元件,并且应用到代谢工程研究中。研究结果如下：1以酿酒酵母无机焦磷酸酶为研究对象,在pET表达系统下,通过加入两个和四个稀有密码子,下调了蛋白表达。将同样的质粒转入Rosetta,补充了稀有密码子对应的tRNA,表达得到回复。初步验证了,稀有密码子可以下调蛋白表达的概念。2在OR、RR、RRRR结果基础上对调控元件进行DpnI点突变,筛选并验证了一系列的密码子调控元件,进行相对活性分析,蛋白表达由高到低依次为OR （100.00）、RGGR（75.50）、RS （70.61）、RGRG （56.35）、RR （42.99）、 RRSR （30.37）、RRGR （22.36）、RRRG （4.39）、RRRS （2.91）、RRRR（0）,共计9个,呈逐渐下调趋势,可在较大范围内下调蛋白的表达。将OR、RR、RRRR由ATG后的+21位前移到+2,差异依然存在。3将部分密码子调控元件RR、RRRR、RRRS、RRRG,应用到pBAD表达系统,得到了与在pET系统下相近的结果,但部分元件的下调幅度有削减,其中RR的相对活性由42.99变为68.57,RRRS的相对活性由2.91变为51.74,RRRG的相对活性由4.39变为57.28。4在蛋白表达形式多为包涵体的BglA前加入筛选的密码子调控元件,总蛋白表达均有不同程度的下调,可溶性蛋白表达由高到低依次为SS（141.15）、G2G2 （139.40）、G1G1 （132.17）、OR （100.00）、RR （65.09）、RRSR （37.66）、RRGR （20.59）,其中,SS和G2G2两个样品比原始蛋白的可溶性提高了1.4倍,且总蛋白没有增加。5对MEP途径改造过程中,加入密码子调控元件的IspG表达量均有不同程度的下调,不同的表达水平对应的neurosporene的产量也有所不同。RRRR-IspG的表达水平下,neurosporene可以取得最高的产量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 大肠杆菌表达系统的组成
• 1.1 表达载体
• 1.1.1 启动子
• 1.1.2 SD序列
• 1.1.3 转录终止子
• 1.2 外源基因结构
• 1.3 表达宿主菌
• 2 大肠杆菌表达系统存在的一些问题
• 3 影响外源基因表达的因素
• 3.1 转录水平因素对外源基因表达的影响
• 3.2 翻译水平因素对外源基因表达的影响
• 4 密码子偏好性对蛋白表达的影响
• 4.1 密码子偏好性
• 4.2 稀有密码子对蛋白表达的影响
• 5 本研究的目的、意义及主要内容
• 第二章 材料与方法
• 1 焦磷酸酶的克隆表达及稀有密码子对其表达的影响
• 1.1 材料、仪器与试剂
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 培养基和溶液
• 1.1.4 生化试剂
• 1.2 方法与步骤
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 酵母基因组DNA的提取
• 1.2.3 稀有密码子系列无机焦磷酸酶基因扩增
• 1.2.4 DNA产物纯化试剂盒纯化PCR产物
• 1.2.5 质粒的提取
• 1.2.6 质粒pET-28a（+）和目的片段的双酶切
• 1.2.7 普通DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段
• 1.2.8 原核表达载体pET-28a（+）与目的片段连接
• 1.2.9 大肠杆菌DH5α化转感受态细胞的制备
• 1.2.10 连接产物的转化
• 1.2.11 阳性克隆子的筛选与鉴定
• 1.2.12 重组质粒转化至表达宿主菌
• 1.2.13 表达蛋白的SDS-PAGE分析
• 2 定点突变筛选不同密码子调控元件下调蛋白表达
• 2.1 材料、仪器与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 培养基和溶液
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 突变位点的确定
• 2.2.2 突变方法
• 2.2.3 突变引物设计
• 2.2.4 PCR扩增质粒进行点突变
• 2.2.5 无机焦磷酸酶相对活性分析
• 3 密码子调控元件在不同位置以及不同表达系统对蛋白表达的影响
• 3.1 材料、仪器与试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 培养基和溶液
• 3.2 方法与步骤
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 稀有密码子系列无机焦磷酸酶基因扩增
• 4 密码子调控元件在不同蛋白及代谢途经改造上的应用
• 4.1 材料、仪器与试剂
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 培养基和溶液
• 4.2 方法与步骤
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 细菌基因组DNA的提取
• 4.2.3 β-葡萄糖苷酶的扩增
• 4.2.4 β-葡萄糖苷酶的相对活性测定
• 4.2.5 IspG的扩增
• 4.2.6 Neurosporene产量检测方法
• 第三章 结果与分析
• 1 不同数量的稀有密码子R（精氨酸）对蛋白表达的影响
• 1.1 不同数量R系列无机焦磷酸酶（PPA）基因的扩增
• 1.2 R密码子系列无机焦磷酸酶原核表达载体的构建
• 1.3 稀有密码子对无机焦磷酸酶蛋白表达的影响
• 1.4 R密码子系列无机焦磷酸酶在Rosetta（DE3）中进行表达
• 2 利用DPN Ⅰ定点突变法获得不同的密码子调控元件
• 2.1 定点突变无机焦磷酸酶基因的扩增及测序鉴定
• 2.2 不同的密码子调控元件对无机焦磷酸酶蛋白表达的影响
• 2.3 不同的密码子调控元件下无机焦磷酸酶的相对活性分析
• 2.3.1 无机焦磷酸酶反应初速率时间范围的确定
• 2.3.2 无机焦磷酸酶的相对活性分析
• 2.3.3 不同的密码子调控元件载体在Rosetta中蛋白表达
• 3 不同位置密码子对无机焦磷酸酶表达的影响
• 3.1 密码子系列无机焦磷酸酶原核表达载体的构建
• 3.2 pET-21a（+）密码子系列无机焦磷酸酶的表达分析
• 4 PBAD表达系统下密码子调控元件对无机焦磷酸酶表达的影响
• 4.1 pBAD系统下不同密码子系列无机焦磷酸酶的扩增
• 4.2 pBAD系统下不同密码子系列无机焦磷酸酶原核表达载体的构建
• 4.3 pBAD表达系统下不同密码子无机焦磷酸酶的表达分析
• 4.4 pBAD表达系统下不同密码子无机焦磷酸酶的相对活性分析
• 5 不同的蛋白（B-葡萄糖苷酶）在密码子调控元件下的表达情况
• 5.1 不同密码子系列β-葡萄糖苷酶PCR扩增
• 5.2 不同密码子系列β-葡萄糖苷酶原核表达载体的构建
• 5.3 不同密码子调控元件下β-葡萄糖苷酶表达分析
• 5.4 不同密码子调控元件下β-葡萄糖苷酶相对活性分析
• 6 密码子调控元件在代谢途径改造上的应用
• 6.1 不同密码子系列IspG的PCR扩增
• 6.2 不同密码子系列IspG原核表达载体的构建
• 6.3 不同表达水平IspG对MEP途径的影响
• 7 讨论
• 第四章 本研究的主要结论
• 参考文献
• 附录1 部分试剂药品配方
• 附录2 缩略词
• 致谢