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微生物发酵及两阶段混合培养产3-羟基丙酸

2020-12-07阅读(846)

微生物发酵及两阶段混合培养产3-羟基丙酸

论文摘要

3-羟基丙酸（3-HP）具有许多优良的化学性质,可以作为中间体合成多种有经济价值的工业用化合物,是一种潜在的重要化工平台产品。本文以褶皱假丝酵母（Candida Rugosa）为研究对象,对发酵法生产3-HP进行了研究。首先,建立了分析3-HP的高效液相色谱法。本文主要考察了色谱柱、柱温、流动相流速、流动相配比以及流动相pH值的影响,优化了3-HP的高效液相检测条件。其最佳色谱条件为:示差折光检测器,Diamonsil C18（4.6×250 mm,5μm）色谱柱,流动相为5%甲醇,含0.005 mol/L H2SO4,流速为1.0 mL/min,柱温为45℃,进样量为5μL。在此最佳色谱条件下,发酵液中3-HP、乳酸和丙酸能得到良好分离,且3-HP样品在0～324 mg/mL范围内呈线性关系,相关系数r=0.99998,加标回收率为98.04%-100.06%,检出限为5μg/mL,RSD（n=5）为1.08%。其次,优化了发酵液中丙酸的气相色谱条件,其优化条件为:FID检测器;GC-Solution数据处理工作站;AT-FFAP（30 m×0.32 mm×0.5 um）毛细管色谱柱;进样口温度200℃;检测器温度200℃;升温程序:99℃-1 min,80℃/min-160℃-0.5 min,2℃/min-162℃-0.5 min,20℃/min-180℃-0.5 min;载气:氮气;横流模式:线速度:30 cm/sec、H2流量40 mL/min、空气流量400 mL/min、尾吹流量30 mL/min;采用分流进样方式,分流比:100;进样量1μL。结果表明:此方法测试时间短,准确度高,分离效果和重复性好,其回收率都大于98%,,RSD为1.05%。然后,以产3-HP的褶皱假丝酵母为出发菌株,通过紫外诱变和亚硝基胍诱变筛选得到高产突变株C3,产量达到0.55 mg/mL,是诱变出发菌株的产量的3.06倍。并对其发酵培养基进行了优化,优化后的培养基组成为:甘油2.0%,酵母浸膏0.6%,麦芽汁0.9%,（NH4）2SO41.5%,KH2PO40.9%,K2HPO40.3%,MgSO4·7H2O 0.3%,FeSO4·7H2O 0.003%,pH 6.0-6.5,培养温度30℃,并确定了最佳培养时间为72 h。另外,研究了微生物发酵生产丙酸的条件,得出最佳的培养条件为:葡萄糖2.5%,酵母浸膏2.0%,蛋白胨3.0%,六水合氯化钴11 mL（6ppm）,NaCl 0.5%,pH值7.0-7.5,种子液培养时间4-5 d,接种量10%,发酵培养时间7-9 d。最后,研究了微生物两阶段混合发酵产3-HP的条件,得出褶皱假丝酵母的最佳接种时间为产酸丙酸杆菌培养9.5 d、接种量为15%、培养温度30℃。在此条件下,3-HP的产量可达2.16 mg/mL。与单独培养产量0.73mg/mL进行比较,产量提高了2倍。实验证明混合培养中,两种菌相互促进,不仅提高了3-HP产量,还降低了成本,而且具有条件温和、副产物少、绿色环保等优点。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 引言
  • 1.2 3-羟基丙酸的概况
  • 1.2.1 3-羟基丙酸的理化性质
  • 1.2.2 3-羟基丙酸在微生物体内的代谢途径
  • 1.2.3 3-羟基丙酸的应用
  • 1.3 3-羟基丙酸的生产方法
  • 1.3.1 化学法生产3-羟基丙酸
  • 1.3.2 生物法生产3-羟基丙酸
  • 1.4 丙酸的概况和生产方法
  • 1.4.1 丙酸的理化性质和应用
  • 1.4.2 丙酸的生产方法
  • 1.4.3 丙酸的现阶段最新研究状况及展望
  • 1.4.4 丙酸的提取方法和含量检测
  • 1.5 高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）的简介
  • 1.5.1 高效液相色谱概述
  • 1.5.2 高效液相色谱的分类
  • 1.5.3 最佳色谱分离条件的选择
  • 1.5.4 气相色谱概述
  • 1.6 本文的研究目的和内容
  • 1.6.1 本文研究的目的和意义
  • 1.6.2 本文的研究内容
  • 第二章 分析方法的建立
  • 第一部分 高效液相色谱法分析发酵液中的3-羟基丙酸
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料与方法
  • 2.2.1 菌种
  • 2.2.2 主要培养基
  • 2.2.3 实验方法
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 色谱分析条件的选择
  • 2.3.2 回归分析、检出限测定
  • 2.3.3 仪器的精密度实验
  • 2.3.4 稳定性实验
  • 2.3.5 回收率测定
  • 2.4 小结
  • 第二部分 毛细管气相色谱法分析发酵液中的丙酸
  • 2.5 引言
  • 2.6 实验材料与方法
  • 2.6.1 菌种
  • 2.6.2 主要培养基
  • 2.6.3 实验方法
  • 2.7 结果与讨论
  • 2.7.1 色谱条件的选择
  • 2.7.2 定性分析
  • 2.7.3 标准曲线的测定
  • 2.7.4 精密度试验
  • 2.7.5 回收率试验
  • 2.7.6 样品测定
  • 2.8 小结
  • 第三章 菌种选育以及皱褶假丝酵母突变株发酵产3-羟基丙酸的条件优化
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验材料与方法
  • 3.2.1 菌种
  • 3.2.2 主要培养基
  • 3.2.3 实验方法
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 不同丙酸浓度诱导后，菌体产3-羟基丙酸的情况分析
  • 3.3.2 紫外诱变对菌种的影响
  • 3.3.3 化学试剂（NTG）诱变对菌种的影响
  • 3.3.4 褶皱假丝酵母生长曲线的测定
  • 3.3.5 碳源的选择优化
  • 3.3.6 氮源的选择优化
  • 3.3.7 温度和pH的影响
  • 3.3.8 讨论
  • 3.4 本章小结
  • 第四章 产酸丙酸杆菌发酵产丙酸的条件优化
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验材料与方法
  • 4.2.1 菌种
  • 4.2.2 主要培养基
  • 4.2.3 实验方法
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 种子液中菌株的生长情况
  • 4.3.2 发酵液中菌株生长情况
  • 4.3.3 不同接种量的影响
  • 4.3.4 碳源的选择优化
  • 4.3.5 氮源的选择优化
  • 4.3.6 碳氮比的选择优化
  • 4.3.7 温度和pH的影响
  • 4.3.8 丙酸提取条件的优化
  • 4.4 小结
  • 第五章 初步探索产酸丙酸杆菌与褶皱假丝酵母联合培养生产3-羟基丙酸的条件
  • 5.1 引言
  • 5.2 实验材料与方法
  • 5.2.1 菌种
  • 5.2.2 主要培养基
  • 5.2.3 实验方法
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 产酸丙酸杆菌培养不同时间后丙酸和乙酸的含量
  • 5.3.2 产酸丙酸杆菌接种量对3-羟基丙酸产量的影响
  • 5.4 小结
  • 第六章 结论与建议
  • 6.1 结论
  • 6.2 问题与建议
  • 参考文献
  • 附录
  • 附录一 实验试剂
  • 附录二 主要实验仪器
  • 致谢
  • 研究成果及发表的学术论文
  • 作者和导师简介
  • 北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书

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