鳗弧菌及其致病因子的检测及减毒突变株和灭活疫苗的研究

论文题目: 鳗弧菌及其致病因子的检测及减毒突变株和灭活疫苗的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 海洋生物学

作者: 张振冬

导师: 张培军

关键词: 鳗弧菌,致病因子,胞外产物,灭活疫苗,同源重组

文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 从患病牙鲆(Paralichthys olivaceus)分离到一株毒力较强鳗弧菌 M3。鳗弧菌 M3 分泌的胞外产物(extracellular products,ECP)对鳗弧菌的生长有明显的促进作用,通过溶血和蛋白质降解实验以及对牙鲆、金鱼、大鼠等的感染,表明 ECP具有较强的毒力,可导致牙鲆和金鱼死亡。对 ECP 进行分离纯化,经超滤、Sephadex G-100 凝胶层析、DEAE-cellulose 离子交换层析,得到一纯化的毒性蛋白—分子量约为 36 kD 金属蛋白酶。制备了高效价、特异性良好的兔抗鳗弧菌 M3 抗体和金属蛋白酶抗体,利用玻片凝集法、荧光抗体法、酶联免疫吸附法等免疫学以及 PCR 分子检测方法,对鳗弧菌 M3 进行定性和定量检测,结果表明 PCR 检测法最为灵敏和特异。经肌肉注射感染牙鲆后,利用组织匀浆涂布培养的方法对各组织中侵染的病原进行分离,利用玻片凝集和 PCR 对病原进行检测鉴定,结果发现鳗弧菌 M3 通过肌肉途径侵染牙鲆的过程为:肌肉→血液→肝脏→肾→脾→肠和鳃。利用间接荧光抗体技术对牙鲆组织中 M3 的侵染情况进行定位检测,发现在感染牙鲆的肝、脾、肾等重要器官均检测到 M3 的侵染。利用 Western 印迹、间接 ELISA 以及 dot-ELISA 法对 M3 胞外产物中的金属蛋白酶进行了定量检测,Western 印迹的灵敏度为 6.25 ng,间接 ELISA 法的灵敏度为 7.8 ng,dot-ELISA 法的灵敏度为 7 pg。利用 dot-ELISA 法对金属蛋白酶在鳗弧菌侵染牙鲆宿主和在纯培养过程中的表达进行检测。在纯培养过程中,金属蛋白酶在接种后 2 h 可以在培养基上清中被检测到,随着培养时间的延长其表达量逐渐增加;在侵染牙鲆宿主过程中,感染后 5~6 h 在血液中在可以检测到金属蛋白酶的表达,分泌量随着感染的发展而增加。制备了鳗弧菌 M3 的福尔马林灭活疫苗,用肌肉注射方式对牙鲆进行免疫接种。免疫后 14 d 可检测到免疫组牙鲆具有明显的保护性抗体产生,28～35 d 抗体效价增加明显。血清溶菌活力和超氧化物歧化酶(SOD)活力提高,外周血细胞吞噬能力增强,并且发现牙鲆红细胞具有较强的吞噬能力。免疫组牙鲆对人工

论文目录:

第一章引言

第一节病原菌检测技术在水产养殖动物中的应用

1.1 分类鉴定方法

1.2 免疫学检测技术

1.2.1 免疫荧光技术

1.2.2 免疫酶技术

1.2.3 Western 印迹法

1.3 核酸检测技术

1.3.1 核酸杂交技术

1.3.2 PCR 检测技术

1.3.3 基因芯片技术

1.3.4 DNA 指纹技术

1.3.5 16S rRNA 检测技术

1.4 核酸技术与免疫学相结合方法

1.4.1 免疫PCR

1.4.2 PCR-ELISA

第二节病原菌对宿主的侵染

2.1 病原菌的致病力

2.1.1 粘附和侵入能力

2.1.2 繁殖与扩散能力

2.1.3 对宿主防御机能的抵抗能力

2.1.4 产毒素能力

2.2 病原菌的毒力质粒和毒力岛

2.2.1 质粒与荚膜

2.2.2 质粒与菌毛

2.2.3 质粒与细菌的外毒素

2.2.4 毒力岛

2.3 微生物基因组学

2.4 微生物蛋白质组学

第三节鱼类免疫系统的研究进展

3.1 免疫组织与器官

3.1.1 胸腺

3.1.2 肾脏

3.1.3 脾脏

3.1.4 粘膜淋巴组织

3.2 免疫细胞

3.2.1 淋巴细胞

3.2.2 吞噬细胞

3.2.2.1 单核细胞

3.2.2.2 巨噬细胞

3.2.2.3 粒细胞

3.3 体液免疫因子

3.3.1 抗体

3.3.2 非特异性免疫因子

第二章牙鲆致病性鳗弧菌及其毒性蛋白酶的检测

第一节鳗弧菌 M3 的检测及对牙鲆的侵染

1 材料和方法

2 实验结果

2.1 M3 抗血清的效价及特异性

2.2 鳗弧菌 M3 检测方法

2.3 鳗弧菌对牙鲆的侵染过程

3 讨论

第二节鳗弧菌金属蛋白酶的检测及在侵染中表达

1 材料和方法

2 实验结果

2.1 ECP 的毒力

2.2 金属蛋白酶的分离纯化

2.3 抗体效价及特异性检测

2.4 金属蛋白酶的检测

2.5 侵染过程中金属蛋白酶的表达

3 讨论

第三章鳗弧菌灭活疫苗对牙鲆的免疫效果

1 材料和方法

2. 实验结果

2.1 福尔马林灭活浓度

2.2 福尔马林灭活疫苗安全性

2.3 免疫指标检测

3 讨论

第四章鳗弧菌angR 基因插入失活突变株构建

1 材料和方法

2 实验结果

2.1 M3 基因组文库部分测序

2.2 angR 基因部分编码区的扩增

2.3 细菌接合构建突变株

2.4 突变子的鉴定

2.5 鳗弧菌突变株 MD 与野生菌株 M3 的胞外产物和菌体蛋白成分的比较分析

2.6 毒力实验

3 讨论

结论

参考文献

发表文章

致谢

发布时间: 2005-07-05

参考文献

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