木薯块根蔗糖卸载的酶学机制

论文摘要

高等植物中,叶片的光合作用产物是植物的非光合器官的生长和能量物质的贮存的来源,大多数植物中,光合同化物通过韧皮部长途运输至库器官,然后再经库器官的卸载和后转运代谢,这一过程涉及到许多酶和糖转运载体蛋白的作用,揭示这一代谢过程对于植物的糖代谢机理具有重要意义。目前,人们对木薯蔗糖卸载的过程和机理知之甚少,对于不同块根发育阶段蔗糖代谢相关酶活性、糖含量和转运载体的基因表达情况,对于木薯高淀粉品种和低淀粉品种的糖积累差异如何尚不清楚。本研究选取两个木薯品种华南7号（低淀粉）和华南9号（高淀粉）为材料,对其不同生育期的蔗糖卸载相关酶（细胞壁酸性转化酶（CWI）、可溶性酸性转化酶（SAI）、中性转化酶（NIV）、蔗糖合成酶（SuSy）、蔗糖磷酸合成酶（SPS））和可溶性糖（蔗糖、葡萄糖、果糖）含量进行了测定,并对MeCWI、己糖转运载体（MeHT）、蔗糖转运载体-1（MeSUT-1）、蔗糖转运载体-2（MeSUT-2）、蔗糖转运载体4-1（MeSUT4-1）、蔗糖转运载体4-2（MeSUT4-2）六个基因表达量进行了分析,还对关键酶CWI进行了Western印迹分析,以期了解木薯中品种间糖积累差异和各生长阶段的糖卸载情况。本研究结果表明,蔗糖卸载相关酶中,CWI在两个品种中趋势相反,而其他两种转化酶趋势则较为一致,且其CWI活性远高于其他酶活性,推断该酶可能与两个木薯品种淀粉含量差异有关；SPS在整个发育期活性较低,推测此酶是与其他蔗糖相关酶协同作用进行蔗糖的再合成；SuSy合成方向远高于分解方向,说明在糖卸载并转运至细胞质以后,单糖又重新进行了蔗糖合成,来参与代谢活动。蔗糖、葡萄糖和果糖在两个木薯品种中均有积累；在华南7号块根木质部中,三者的变化规律较为相似,均在膨大中期较低,膨大末期达到最高值,韧皮部中,三种糖的含量总体比木质部高,变化趋势与木质部相似；华南9号块根木质部中,三种糖的积累主要在中期,后期逐渐降低,韧皮部中其含量变化正好相反；两个品种糖含量的差异可能与其蔗糖代谢产生淀粉能力大小有关。MeCWI表达量在两个品种中表达趋势平缓,前期和后期表达略高；一MeHT在华南7号中木质部后期表达较高,而韧皮部则较平缓,MeHT在华南9号中两个部位表达前期较高,暗示了两个品种己糖运输时间和部位并不完全相同；MeSUT-1表达量主要在木薯块根发育中后期,MeSUT-2、MeSUT4-1、MeSUT4-2在木质部中的表达在发育中期较高,而在韧皮部中的表达在发育前期较高；可以推测,MeCWI活性和糖转运载体在不同时空表达的差异性可能是造成两个品种淀粉含量差异的原因之一。CWI在蔗糖的质外卸载中起关键作用,Western印迹分析显示,两个木薯品种的木质部中,CWI在发育后期含量较高；韧皮部中,CWI蛋白在发育前期较高,且华南9号CWI蛋白表达量总体要高于华南7号木薯,推测华南9号的蔗糖卸载能力高于华南7号。以上研究将为进一步研究木薯块根的蔗糖卸载完整机制和途径,从而在将来通过生物技术手段进行作物农艺性状改良打下基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 木薯概况
• 1.1.1 木薯植物学特征
• 1.1.2 木薯农艺和栽培方面
• 1.2 高等植物蔗糖卸载和运输理论研究
• 1.2.1 源-库理论
• 1.2.2 植物蔗糖转运系统
• 1.2.2.1 质外体途径
• 1.2.2.2 共质体途径
• 1.3 蔗糖卸载相关的酶
• 1.3.1 蔗糖合成酶
• 1.3.2 转化酶
• 1.3.3 蔗糖磷酸合成酶
• 1.4 糖转运载体
• 1.4.1 蔗糖转运载体
• 1.4.2 己糖转运载体
• 1.5 研究的目的意义
• 第二章 木薯块根蔗糖卸载相关酶的活性
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 实验试剂
• 2.2.1.2 实验仪器
• 2.2.2 粗酶液的提取
• 2.2.2.1 蔗糖合酶（合成方向）
• 2.2.2.2 蔗糖合酶（分解方向）
• 2.2.2.3 细胞壁酸性转化酶
• 2.2.2.4 可溶性酸性转化酶
• 2.2.2.5 中性转化酶
• 2.2.2.6 蔗糖磷酸合成酶
• 2.3 结果与分析
• 2.4 小结
• 第三章 糖卸载过程中蔗糖和葡萄糖、果糖的检测
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 药品与试剂
• 3.2.3 仪器设备
• 3.2.4 样品制备和分析方法
• 3.2.5 标准曲线的制作
• 3.2.6 数据计算和分析
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 单糖保留时间
• 3.3.2 混标标准曲线
• 3.3.3 蔗糖含量的变化
• 3.4 小结
• 第四章:木薯块根蔗糖卸载过程中细胞壁酸性转化酶（MeCWI）、蔗糖转运载体（MeHT）、己糖转运载体（MeSUT）的基因表达研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 药品与试剂
• 4.2.3 仪器设备
• 4.2.4 木薯块根的总RNA提取
• 4.2.5 核酸的凝胶电泳检测和浓度测定
• 4.2.5.1 凝胶电泳检测
• 4.2.5.2 RNA的浓度测定
• 4.2.6 cDNA的合成
• 4.2.7 Real-time PCR引物的设计和特异性检验
• 4.2.8 Real-time PCR检验蔗糖卸载相关基因的转录表达
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 木薯块根总RNA的提取
• 4.3.2 用于Real-time的引物特异性的验证
• 4.3.3 木薯块根中细胞壁酸性转化酶、己糖转运载体、蔗糖转运载体基因的时空表达
• 4.3.3.1 MeCWI的表达情况
• 4.3.3.2 MeHT的表达情况
• 4.3.3.3 MeSUT的表达情况
• 4.4 小结
• 第五章 木薯块根细胞壁酸性转化酶western blotting
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料和方法
• 5.3 实验药品
• 5.4 实验器材
• 5.5 蛋白提取
• 5.6 SDS-PAGE和Western blotting 分析
• 5.6.1 SDS-PAGE
• 5.6.2 电转
• 5.6.3 Western Blottnig
• 5.7 实验结果与分析
• 5.8 小结
• 第六章 全文总结与展望
• 6.1 全文总结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 硕士期间发表文章
• 致谢