大肠杆菌O157二重荧光定量PCR检测及分离菌株的分子多态性分析

论文摘要

大肠杆菌0157是肠出血性大肠杆菌的主要血清型，能够引起人类出血性腹泻及溶血性尿毒综合征（HUS）等。流行病学研究表明极低量的大肠杆菌0157即可致感染，因此高敏感度的检测方法对检测大肠杆菌0157显得尤其重要。以大肠杆菌0157 rfbE和stx2为待检靶基因，设计两对引物和两条MGB探针，以rfbE为靶基因的探针，5’端用FAM基团标记，3’端用Taqman-MGB标记，以stx2为靶基因的探针，5’端用VIC基团标记，3’端用Taqman-MGB标记。基于Taqman探针技术，建立并优化了检测大肠杆菌0157的二重荧光定量PCR方法。可检测的最低DNA浓度是100拷贝／μL；试验中已知0157菌株检测结果为rfbE阳性，而非0157菌株检测结果为阴性；重复性实验中，批间差异小于80％，批内差异小于70％。实验结果显示，此二重荧光定量PCR方法既可鉴定分离的菌株是否为大肠杆菌0157，又可得知菌株是否携带stx2毒力基因，有利于判定菌株是否有致病性。用建立的以rfbE和stx2为靶基因的二重荧光定量PCR，鉴定2000-2004年间分离的64株来源于动物组织和粪便的细菌。并应用荧光定量PCR进行模拟样本的检测，采集的猪肉肉样无菌处理剪碎后置于10mL EC（含20μg╱mL新生霉素）肉汤中，利用菌落计数法测得大肠杆菌0157标准株纯培养液浓度，作10倍倍比稀释，将不同浓度的菌液分别接种到肉糜EC肉汤中，制备得含不同细菌浓度的模拟样本，分别提取各样本中细菌基因组作模板，进行二重荧光定量PCR检测。检测结果表明：10株细菌针对rfbE和stx2均能产生特异性扩增曲线，54株细菌的扩增曲线位于域值线以下，即未出现指数扩增。说明出现扩增曲线的10株细菌是大肠杆菌0157，未出现指数扩增的54株细菌是非0157大肠杆菌，荧光定量PCR法和血清学检测结果完全一致。大肠杆菌0157标准株纯培养液浓度为3．05×106CFU／μL，模拟样本荧光定量PCR检测的灵敏度为3．05×100CFU／μL，即每克猪肉中含有30．5个细菌就可以检出，提供了一个敏感、特异的检测和鉴定大肠杆菌0157的方法。为了解分离菌株的分子分型特征，建立了随机扩增多态性和质粒图谱分析两种分型方法，对10株从粪便和动物组织分离的大肠杆菌0157进行了分型研究，结合重要毒力基因的检测和药敏试验，以进一步验证分离菌株之间的亲缘关系。随机扩增多态性分析分别在遗传距离为0.89、0.973处将所有细菌分类：两株具有相似的扩增图谱，可以聚为一大类，其余8株细菌进行分类。质粒图谱分析在不同的进化距离处将所有细菌分类，形成具有复杂分枝的树状图。比较两种方法的图谱发现：它们具有相似的结果，质粒图谱法分析更能反映出菌株之间的进化关系。毒力因子检测结果显示：10株细菌均含有hly、eae、uid、flich7基因。药敏试验表明：属于第一类的两株细菌具有不同于其它8株细菌的耐药谱，与随机扩增多态性分析和质粒图谱分析相一致。

论文目录

• 全文摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 大肠杆菌O157毒力因子及其检测方法的研究
• 第二章 荧光定量PCR研究进展
• 第二篇 试验部分
• 第三章 大肠杆菌O157二重实时定量PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第四章 运用荧光定量PCR检测分离菌株和模拟样本中大肠杆菌O157
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第五章 大肠杆菌O157分离菌株的分子多态性分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 全文总结
• 致谢