论文摘要
口蹄疫（Foot and mouth Disease, FMD）和羊痘（Capripox）均被世界动物卫生组织列为极其重要传染病,虽然山羊和绵羊不如牛和猪易感,但是山羊和绵羊感染口蹄疫病毒后会长期带毒,成为隐性带毒者,这给该病的防制增加了难度。目前,在多数国家,灭活苗仍然是防制口蹄疫的主要方法,但是往往灭活过程中会存在灭活不全而可能引起散毒,而且灭活苗引起的免疫保护期不够持久。重组基因工程疫苗虽然更安全,更经济,但是往往不能产生对机体的完全保护,因此有必要开发各种免疫佐剂来增强疫苗的免疫效果。虽然目前已经有很多商品化佐剂如佛氏完全佐剂、铝盐佐剂、免疫刺激复合物佐剂等,但它们都受到自身的毒性及免疫副作用的限制。最近,佐剂的概念已经扩展为以重组细胞因子与新开发疫苗联合免疫,这种细胞因子类佐剂被称为分子佐剂。干扰素-γ（Interferon gamma, INF-γ）又称II型干扰素,是一种由活化的NK细胞和CD4+、CD8+等T淋巴细胞产生的细胞因子。它显示出低特异性的抗病毒活性,而具有更明显的免疫调节活性。因此,干扰素-γ可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性抗原基因共同表达,从而加强和改善疫苗的免疫效果。以痘病毒作载体表达病原微生物的保护性抗原基因的重组痘病毒活载体疫苗不但能够起到一种疫苗同时防制两种疾病的作用,而且一般比灭活疫苗引起的免疫力更为持久,但也有其不足,表达的口蹄疫病毒蛋白不能引起对机体的完全保护,这也是目前在痘病毒活载体疫苗应用过程中有待解决的问题。利用干扰素-γ免疫佐剂效应,构建以山羊痘病毒作载体共表达口蹄疫病毒蛋白和山羊干扰素-γ的重组痘病毒活载体疫苗可能能为解决上述问题提供新的方法和思路。首先,我们应用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊（Caprine） IFN-γ基因,将其克隆、鉴定及DNA测序分析,测序结果显示克隆的IFN-γ基因全长501个核苷酸,编码166个氨基酸。经SignalP 3.0分析表明,前23个氨基酸为信号肽序列;将去除信号肽的IFN-γ基因插入到原核表达载体pET-30a（+）上,构建原核表达质粒pET30a-CapIFN-γ,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,结果表明目的基因在大肠杆菌中以包涵体形式融合表达。用ProBondTM蛋白纯化试剂盒纯化,用所获得的重组蛋白纯化产物经三次背部皮下多点注射新西兰白兔,制备了兔抗山羊IFN-γ多克隆血清。经Western Blotting鉴定,多克隆抗血清可与纯化的山羊重组蛋白发生特异性反应,说明重组蛋白具有抗原活性,为我们进一步研究它们的免疫治疗作用和免疫佐剂作用奠定了基础。在本实验室成功构建了表达LacZ的重组病毒rGPV-LacZ之后,以O型FMDV vp1基因和山羊IFN-γ基因作为构建重组病毒的靶抗原构建重组转移载体pTK-VP-IFNγ,以rGPV-LacZ为亲本毒株,反向蚀斑筛选以除去LacZ基因,获得了共表达vp1基因和山羊IFN-γ基因的重组病毒rGPV-VP1-IFNγ。经过连续6轮反向蚀斑筛选、纯化,经PCR鉴定获得了一株重组病毒rGPV-VP1-IFNγ。对vp1基因和山羊IFN-γ基因PCR产物进一步测序验证。经间接免疫荧光和Western Blotting以及生长动力学检测,rGPV-VP1-IFNγ感染的细胞用FMDV特异性抗体及制备的羊抗兔多克隆血清可以检测到rGPV-VP1-IFNγ感染的细胞胞浆内荧光。而且重组病毒中表答的VP1蛋白能够与制备的羊抗兔多克隆血清反应。用VSV法检测IFN-γ活性,结果细胞培养上清能抑制VSV产生的细胞病变,其中IFN-γ的效价为160-320U/mL。与疫苗株比较,二者增殖特性无明显差异,在BT细胞上形成的蚀斑大小和形态相同。将rGPV-VP1-IFNγ在BT细胞上连续传12代,并对vp1基因和山羊IFN-γ基因进行PCR检测、病毒滴度测定。结果表明,vp1基因和山羊IFN-γ基因稳定表达,rGPV-VP1-IFNγ在BT细胞上的病毒滴度和细胞病变与rGPV-LacZ、GPV -AV41无明显差异,表明vp1基因和山羊IFN-γ基因的插入并没有改变rGPV-VP1-IFNγ在细胞培养中的生长特性,rGPV-VP1-IFNγ保持了亲本毒株的生物学特性,但是山羊IFN-γ的表达能否影响重组病毒在体内的复制增殖还有待于进行病毒接种实验动物来进行各项指标的检测,从而为研制山羊痘基因工程疫苗的候选毒株提供依据,这将为山羊痘病毒作为载体构建重组活载体疫苗以及细胞因子作为佐剂的应用研究奠定基础。