HLA-A33分子的体外表达及鉴定

论文摘要

人类白细胞抗原（HLA）是一种重要的遗传物质,是目前所知人体最复杂的多态系统。在我国人群中A33表位占A位点表位的21%,是临床中较常见的表位。根据近些年相关报道,HLA-A33表位在多种疾病的病程进展过程中起着重要作用。在我国南方以及Korea统计的结果,HLA-A33与HBV感染后慢性化有较明显的相关性;Luan-Yin Chang博士等的研究表明,HLA-A33型为EV71易感基因型;洪军等人的研究表明,HLA-A33与小儿急性淋巴细胞白血病有遗传相关性（曹海霞等2007）。本研究通过构建HLA-A33表达载体,经重组载体的鉴定、载体的转化及转染、目的蛋白的原核表达及表达水平的检测,初步研究HLA-A33分子与EV71病毒分子之间的相互作用,为研究HLA-A33在相关疾病中的致病作用和免疫机制提供理论基础和实验依据,本研究氛围两部分内容。第一部分:建立稳定表达HLA-A33分子的细胞系及其功能的相关研究。从GenBank查阅人类HLA-A33的基因序列,结合真核表达的特点,优化所得序列的密码子,并且添加必要的限制性酶切位点Nhe I、Xho I及Flag标签蛋白。通过四质粒慢病毒系统将目的基因片段整合到宿主细胞的基因组DNA上。构建的稳定细胞系通过puro筛选可稳定传代的细胞,通过IF,WB,PCR等方法鉴定细胞系。用EV71病毒感染所获得的稳定细胞系,尝试通过CoIP寻找HLA-A33与EV71之间存在相互作用的蛋白质。第二部分:HLA-A33基因在原核细胞中表达及检测。根据原核表达的特点重新优化密码子,选择pET28a作为表达载体,在序列两端添加Nco I和BamH I限制性酶切位点,通过T4连接酶将载体和序列连接,化学转化法转入大肠杆菌TOP10感受态细胞,得到大量克隆并用PCR和测序鉴定目的基因的插入情况。将重组质粒重新转化入表达菌柱BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝成像来检测HLA-A33蛋白在原核细胞内表达情况。原核表达的蛋白添加了BirA酶底物肽和链亲和素标签Streptavidin,为后续构建HLA-A33分子的tetramer四聚体提供实验基础。本实验取得了如下成果:用常用的分子克隆技术成功构建了HLA-A33的原核表达载体,实现HLA-A33蛋白在原核细胞内的高效表达,并对表达蛋白进行了检测分析;利用慢病毒系统转染法获得了HLA-A33稳定细胞系并利用稳定细胞系初步进行EV71与HLA-A33相互作用蛋白的分析。实验的成果对于HLA-A33的后续研究具有重要的理论意义并提供坚实的实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1. 前言
• 1.1 HLA 研究现状
• 1.1.1 HLA 简述
• 1.1.2 HLA 分类
• 1.1.3 HLA 分型技术
• 1.1.3.1 血清学分型技术
• 1.1.3.2 细胞学分型技术
• 1.1.3.3.D NA 分型技术
• 1.1.4 HLA 与疾病的关系
• 1.1.5 HLA 的功能
• 1.1.6 临床研究现状
• 1.2 HLA 与HBV 感染
• 1.3 HLA 与EV71 感染
• 1.4 慢病毒系统
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料及试剂
• 2.1.1 常用试剂及耗材
• 2.1.2 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 HLA-A33 原核表达载体的构建
• 2.2.1.1 优化HLA-A33 基因
• 2.2.1.2 设计鉴定引物
• 2.2.1.3 扩增目的基因片段HLA-A33
• 2.2.1.4 PCR 产物纯化
• 2.2.1.5 构建pET28a-A33 克隆
• 2.2.1.6 重组克隆pET28a-A33 的鉴定
• 2.2.1.7 目的基因片段HLA-A33 在原核细胞内表达
• 2.2.2 构建稳定表达HLA-A33 细胞系
• 2.2.2.1 HLA-A33 基因的优化
• 2.2.2.2 HLA-A33 基因的鉴定和PCR 扩增
• 2.2.2.3 HLA-A33 序列鉴定
• 2.2.2.4 构建稳定表达HLA-A33 基因的细胞系
• 2.2.3 HLA-A33 分子与EV71 相互作用的蛋白
• 2.2.3.1 易感细胞的鉴定
• 2.2.3.2 病毒的扩增及纯化
• 2.2.3.3 病毒滴度的测定（TCID50 法）
• 2.2.3.4 EV71 病毒感染RD-A33 细胞
• 2.2.3.5 免疫共沉淀
• 2.2.3.6 蛋白质银染
• 2.2.3.7 质谱分析
• 3. 实验结果
• 3.1 原核表达HLA-A33
• 3.1.1 HLA-A33 基因片段扩增
• 3.1.2 构建pET28a-A33 表达载体
• 3.1.3 诱导表达HLA-A33
• 3.2 构建HLA-A33 稳定细胞系
• 3.2.1 PCR 扩增HLA-A33 基因
• 3.2.2 PCR 产物回收
• 3.2.3 连接产物转化
• 3.2.4 阳性克隆PCR 鉴定
• 3.2.5 质粒双酶切
• 3.2.6 连接反应
• 3.2.7 假病毒包装
• 3.2.8 RD 细胞puro 抗性浓度筛选
• 3.2.9 构建稳定细胞系
• 3.2.10 WB 检测目的蛋白表达
• 3.2.11 IF 检测目的蛋白表达
• 3.3 HLA-A33 与EV71 的相互作用
• 3.3.1 RD 细胞的易感性鉴定
• 3.3.2 纯化后的EV71 病毒滴度的测定
• 3.3.3 EV71 感染RD-A33 细胞
• 3.3.4 CoIP 凝胶银染
• 4. 讨论
• 4.1 HLA-A33 原核细胞的表达
• 4.2 HLA-A33 真核表达
• 5. 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介及攻读学位期间发表论文
• 附件