论文摘要
植物次生代谢产物是医药、化工、食品和农业高附加值产品的重要原料,其中萜类化合物是植物次生代谢产物的主要组成部分。抗疟药青蒿素及抗肿瘤药紫杉醇、长春花碱等都是著名的萜类药物,其碳链骨架都是通过细胞质或质体的异戊二烯途径合成的。目前,萜类生物合成途径的中间产物及其转变过程已基本阐明,但对萜类合成中基因表达调节的分子机制却了解甚少。为了建立萜类合成基因表达研究平台,本研究以菊科蒿属植物青蒿为模式,采用RTFQ-PCR技术及GUS报告基因表型显示工具,系统而全面地开展青蒿素及其相关萜类生物合成基因在天然及人工模拟环境中的转录调控机制研究。同时,在前期工作基础上,提出“1O2可能是青蒿素合成诱导剂”的假说,并通过实验予以证实。本研究的目的在于建立萜类合成代谢共同途径研究模型;构筑青蒿倍半萜青蒿素合成基因表达研究平台;阐明青蒿素合成诱导及时空调节机制;探索青蒿素高产的可行方法,其主要研究内容及其成果概括如下:①从青蒿中克隆了8种MVA及DXP途径基因（HMGR、FPS、DBR2、DXS、DXR、FS、CS、EPS）并测得全序列,其中DBR2基因序列为首次发表,已提交GenBank注册（登录号为EU848577）,连同我们前期已克隆的ADS、CYP71AV1、CPR、SQS基因,为进一步开展青蒿功能基因组学研究及青蒿素高产代谢基因工程改良提供了丰富的素材。②采用自行设计的扩增引物,对青蒿中9种MVA及DXP途径基因（HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2、DXS、DXR、SQS）的发育特异表达动态进行了跟踪测定,发现相应的mRNA在青蒿中的水平以6月份相对较低,7月份后迅速提高,到8月份（临近开花前）达到顶峰,9月份（开花后）开始回落,其中ADS与CYP71AV1mRNA水平在7月份后更是出现爆发式增长,最高峰时分别为6月份的40倍和18倍。同时还发现,MVA及DXP途径的其他基因与青蒿素合成基因的发育表达模式基本一致,间接表明细胞质MVA途径及质体DXP途径可能共同参与青蒿素的生物合成。③在青蒿组织特异表达动态方面,处于盛花期的青蒿根、茎、叶、花中都能检测到ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2等青蒿素合成基因的表达,而且各基因表达量差异不显著,表明苗期至盛花期间的青蒿素合成基因表达无明显组织特异性。相反,在褐变的老叶中,青蒿素合成相关基因mRNA水平显著提高,其中CYP71AV1、ADS、DBR2mRNA的上升幅度最明显,分别是绿叶的51.2、25.5、14.8倍。相应地,老叶中的青蒿素含量也相应提高,最高约为绿叶的1.5倍,从而首次发现青蒿素合成基因表达与青蒿素的积累可能受生长发育程序尤其是衰老进程的直接调控。由于老叶比绿叶释放更多的1O2,推测1O2直接参与了青蒿素合成基因表达的调控及青蒿素前体向青蒿素的非酶促转变,因而它可能是衰老过程能促进青蒿素大量合成与积累的主要原因。④在转基因烟草ADSP-GUS融合系统中,根、茎、叶中都能检测到GUS活性,表明ADS启动子驱动GUS报告基因的基础表达,在转录调控上无明显组织特异性。GUS定量检测结果显示,在低温（4℃）及紫外辐射条件下,GUS活性分别提高2.2倍和1.6倍,提示ADS基因受极端环境胁迫的诱导调控,对诱导1O2生成的胁迫条件（如低温、紫外辐射等）高度响应。逆境诱导报告基因表型显示平台的成功建立,为进一步高通量筛选青蒿素合成基因高效表达诱导剂提供了极大方便。⑤利用RTFQ-PCR技术分析了青蒿素生物合成相关基因在低温（4℃）、高温（50℃）、紫外辐射、淹水或复水（缺氧）、脱水（干旱）、NaCl（高盐）、真菌诱激（添加酵母提取物）、信号分子刺激（SA、MJ、GA3、ABA）等12种诱生1O2的人工模拟环境中的转录模式。结果显示,在低温与紫外辐射条件下,青蒿素生物合成途径（包括共同途径与特异途径）的基因表达水平普遍上升;ADS和DBR2对于环境胁迫的响应更为明显:ADS在冷、紫外辐射、脱水、添加酵母提取物处理条件下的转录水平分别是对照的35.6、14.2、15.5、5.5倍,DBR2在淹水、复水、添加酵母提取物处理条件下的转录水平分别是对照的1 3.8、38.2和20.7倍。由于上述氧化胁迫条件均能导致1O2释放,因而本研究在成功模拟包括天然衰老过程在内的氧化胁迫条件的基础上,首次揭示了青蒿素合成基因受氧化胁迫尤其是1O2诱导的分子机理。⑥对本实验室首次克隆的7种青蒿新EST——过氧化物酶1基因（POD1）、几丁质酶基因（CH1）、钙调素基因（CaM）、泛素结合酶基因（UCE）、干旱/低温及盐响应蛋白基因（D/LTSRP）、富含甘氨酸RNA结合蛋白基因（RGP）和生长素阻遏/休眠相关蛋白基因（AR/DAP）的低温诱导表达模式进行了定量分析。结果显示,经过4℃处理48h以后,D/LTSRP、UCE、CaM、AR/DAP、POD1基因的mRNA水平分别为对照的7.5、5.0、2.6、2.3、1.5倍,提示这些基因可能参与了青蒿低温信号启动与转导的网络调控,从而为进一步阐明青蒿素生物合成的信号转导通路及其级联调节网络提供了线索。⑦对细胞质与质体萜类合成途径受到抑制后的基因表达定量分析显示,MVA与DXP两条途径表现互为补偿的机制,添加DXP途径抑制剂（磷甘霉素）后,DXP途径基因表达出现先抑制后恢复,而MVA途径基因表达则呈现先上升后回落的趋势;添加MVA途径抑制剂（洛伐他汀）后,两条途径的基因表达均被抑制,进一步表明不同的亚细胞空间（细胞质和质体）在萜类合成过程中存在着交叉对话,再次证实MVA与DXP途径都参与了青蒿素的生物合成。咪康唑对类固醇合成的抑制显示,青蒿素合成基因ADS和DBR2的表达分别提高了2倍和5倍,表明对青蒿素合成竞争途径的抑制可调节MVA途径不同分支中碳源的流向,使细胞代谢向合成青蒿素的方向移动。⑧对转asSQS基因青蒿株中SQS基因及其他倍半萜合酶基因的表达变化研究表明,在转基因株中,SQS基因的表达受到明显抑制,为非转基因的0.5-0.12倍,有2株转基因株中的ADS基因表达提高3.5和3倍。经过4℃间歇冷处理后,非转基因与转基因株中的SQS基因表达不受影响,ADS与EPS基因的表达水平上调1.5-5倍,FS基因表达基本维持不变,CS基因的表达量下降,下降幅度约为50-100倍。再次证明青蒿中萜类合成具有网络调控特性,在“节流”与“引流”的双重作用下更有利于吸引碳源流向青蒿素合成途径。本研究的创新性在于首次从转录水平上开展了包括青蒿素合成基因在内的青蒿萜类代谢调控研究,为其他萜类（如紫杉醇、长春花碱等）的后续功能基因组学及代谢途径工程研究提供了模式,有关青蒿萜类基因表达及其调控的研究结果国内外均无报道。其次,通过对青蒿素合成基因的时间及空间表达动态的跟踪测定,初步揭示了青蒿素合成基因表达的发育及组织特异调节机制,首次发现青蒿素合成基因表达受衰老程序控制的规律,证实衰老过程中产生的过量1O2可能是诱导青蒿素合成基因高效表达及促进青蒿素高产的主要原因。在此基础上,利用各种环境胁迫条件模拟O2的释放,阐明了青蒿素合成基因的环境诱导表达及其调节机制,从而经由实验直接验证了“1O2是青蒿素合成诱导剂”的假说,并进一步指明青蒿素可能是其前体（双氢青蒿酸）清除1O2后生成的副产品。