产ESBLs和非产ESBLs肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药机制差异的研究

论文摘要

肺炎克雷伯菌作为医院感染病原菌检出率逐年增高,由于抗生素的广泛应用甚至滥用,使其耐药率亦逐年增高。其中产ESBLs是KPn重要的耐药机制之一,同时产ESBLs较非产ESBLs菌株对其他几类抗生素耐药率高,而产ESBLs菌株对其他类抗生素交叉耐药机制,目前国内外尚无系统的研究。目的:1.建立产ESBLs和非产ESBLs肺炎克雷伯菌环丙沙星耐药模型,了解诱导耐药菌对几类常见抗生素的耐药性特点。2.探明应用外排泵抑制剂后两组耐药菌外排泵阳性率的差异。3.探明两组诱导耐药菌诱导前后外膜蛋白表达差异。4.探讨两组诱导耐药菌gyrA和parC基因碱基突变位点的差异。方法:1.对收集的KPn临床菌株按要求进行筛选,分为三类:敏感株（20株）、耐药株（10株）、产ESBLs敏感株（9株）。用环丙沙星对敏感株组和产ESBLs敏感株组菌株进行体外多步法诱导耐药。采用CLSI（2009）推荐的纸片扩散法对敏感株组诱导耐药菌株进行多种抗生素的药敏实验及ESBLs初筛和表型确证试验。2.应用琼脂二倍稀释法测定两组诱导耐药菌对环丙沙星和左氧氟沙星的MIC,以及应用外排泵抑制剂CCCP前后两组诱导耐药菌和临床耐药菌对环丙沙星的MIC的差异,并计算出三组菌株外排泵阳性率。3.用SDS-PAGE电泳观察敏感株组和产ESBLs敏感株组诱导前后外膜蛋白（OMP）表达差异,并于临床耐药株组对照。4.对诱导前后敏感株组和产ESBLs敏感株组菌株的gyrA、parC基因进行聚合酶链反应（PCR）扩增,扩增片段长度分别为879bp、536bp,并对扩增产物进行测序,测序结果用clustalX软件和NCBI的BLAST功能进行序列比对分析,明确诱导前后gyrA、parC基因碱基突变情况。结果:1.20株KPn敏感株组菌株有17株成功诱导为环丙沙星高度耐药株,3株在诱导过程中死亡,平均诱导时间为32.76±3.05天。9株KPn产ESBLs敏感株组菌株均成功诱导为环丙沙星高度耐药株,平均诱导时间为27.78±1.86天。敏感株组17株诱导耐药株对头孢他定、氨曲南、亚胺培南的敏感率为100%（17/17）;阿米卡星敏感率88.2%（15/17）,有两株中介;四环素敏感率52.9%（9/17）,耐药率29.4%（5/17）,有三株中介;而对莫西沙星的耐药率为100%（17/17）;头孢西丁耐药率88.2%（15/17）,有两株中介。经ESBLs初筛和表型确证试验,17株诱导耐药株均为ESBLs阴性。2. 17株敏感株组诱导耐药株对环丙沙星、左氧氟沙星的MIC分别为≥128μg/mL、≥32μg/mL,外排泵阳性率为47%（8/17）;9株产ESBLs敏感株组诱导耐药株对环丙沙星、左氧氟沙星的MIC分别为≥256μg/mL、≥128μg/mL,外排泵阳性率为0;临床耐药株组外排泵阳性率为30%（3/10）,三组耐药菌株外排泵阳性率有统计学差异。3.SDS-PAGE分析发现,KPn敏感株组菌株诱导前后可出现OMP的表达减少或缺失,依其位置判断可能为OmpK35或OmpK36。而产ESBLs敏感株组诱导前后OMP表达基本一致,未出现明显的表达减少或缺失。4.经clustalX软件和NCBI的BLAST功能比对,gyrA基因以514位碱基和742位碱基突变多见,parC基因以406位碱基突变多见,其次为694位碱基。KPn敏感株诱导前后碱基突变差异大,而产ESBLs敏感株诱导耐药前后基因未见明显突变。结论:1.长期低浓度抗生素选择压力易引起细菌耐药,已存在对一类或多类抗生素耐药的耐药菌更易引起对其他类抗生素的耐药性。2.外排泵为肺炎克雷伯菌对喹诺酮类的一种耐药机制,产ESBLs不会增加KPn的外排泵阳性率。3.喹诺酮类抗生素之间存在交叉耐药,同时喹诺酮类抗生素诱导的KPn耐药菌可广泛出现头孢西丁耐药,其共同的耐药机制可能为:外膜蛋白表达减少或缺失。4.非产ESBLsKPn敏感株经喹诺酮类诱导耐药后,可出现外膜蛋白表达减少或缺失。但产ESBLs敏感株在诱导耐药前后外膜蛋白表达无明显变化。在产ESBLs的情况下,细菌的外膜蛋白表达变化不是引起KPn对喹诺酮类耐药的主要原因。5.产ESBLs与KPn的gyrA和parC基因突变关系不大。

论文目录

• 中英文对照
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 研究背景
• 国内外研究现状
• 研究方案
• 技术路线图
• 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 临床菌株
• 1.2 实验仪器及试剂
• 1.3 其它主要试剂的配方
• 2. 实验方法
• 2.1 实验菌株传代培养
• 2.2 实验菌种保存
• 2.3 琼脂稀释法测最低抑菌浓度（MIC）
• 2.4 环丙沙星体外诱导耐药
• 2.5 Kirby-Bauer 法药敏实验
• 2.6 ESBLs 筛选和确证试验
• 2.7 外排泵表型判定
• 2.8 细菌外膜蛋白的制备
• 2.9 外膜蛋白SDS-PAGE 电泳
• 2.10 细菌染色体DNA 提取
• 2.11 引物设计与合成
• 2.12 PCR 扩增
• 2.13 琼脂糖凝胶电泳及胶回收
• 2.14 统计学分析
• 结果
• 1. 体外诱导耐药菌
• 2. 敏感株组诱导耐药菌的药敏结果
• 3. 敏感株组诱导耐药菌ESBLs 检测结果
• 4. 外排泵表型检测
• 5. 外膜蛋白检测
• 6. gyrA, parC 基因突变
• 讨论
• 1. 细菌耐药性诱导的意义
• 2. 产ESBLs 与非产ESBLs 菌株主动外排系统的差异
• 3. 外膜蛋白表达减少或缺失
• 4. gyrA, parC 基因碱基突变
• 结论
• 研究展望
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间论文发表情况