局部应用环氧化酶-2抑制剂抑制DMBA诱导的大鼠舌癌作用的研究

论文摘要

口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma, OSCC）是目前发病率和死亡率较高的恶性肿瘤,约占口腔颌面部恶性肿瘤的80%,而舌鳞状细胞癌是口腔癌中最常见的恶性肿瘤,易早期出现颈部淋巴结转移。目前较为认可的治疗方法是以手术为主并结合放疗和（或）化疗的综合治疗。尽管目前诊疗水平已有很大提高,但由于口腔鳞癌生物学行为以及口腔颌面部解剖结构的特点,其治愈率和生存率仍不令人满意。口腔癌的发生与口腔癌前病变的存在及癌变密切相关,常见的口腔癌前病变包括口腔黏膜白斑、红斑和不典型增生等,其中口腔黏膜白斑是与口腔癌发生发展最为相关的一种癌前病变,其癌变率约3%-5%。由于白斑发病初期患者无明显不适,且病情进展缓慢,早期往往不能引起患者的重视,当局部出现硬结、疣状、溃疡或红斑样病变时,则可能已经转变为原位癌。随着口腔癌前病变的发生和恶变机制的深入研究,特别是分子生物学研究的进展以及分子靶向治疗在肿瘤治疗中的应用,为口腔癌的预防及治疗提供新的思路。流行病学调查发现,长期服用阿司匹林和其它非甾体类抗炎药物（Non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs）治疗其他疾病的人群,除了可以降低结肠息肉的大小和数量外,还可降低结肠息肉恶变的危险性,从而明显降低结直肠癌的发病率。研究还发现,NSAIDs可以用于预防前列腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、乳腺癌以及头颈部鳞癌的发生。NSAIDs的肿瘤防治作用主要与其抑制环氧化酶-2 （Cyclooxygenase-2, COX-2）的活性有关,因此成为预防及治疗恶性肿瘤的研究热点。COX-2是环氧化酶（Cyclooxygenase, COX）的一种诱导型酶,许多癌前病变和恶性肿瘤中均发现COX-2的高表达,如胃肠上皮化生、食道癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、鼻咽癌和口腔癌等。COX-2诱导产生的前列腺素具有促进细胞增生、抑制细胞凋亡以及刺激新生血管形成等多种功能,而COX-2抑制剂可以通过抑制COX-2的表达及活性,进而抑制肿瘤的发生及发展。近年来研究证实,与胃肠道给药相比,透皮给药途径避免了肝脏产生首过效应和代谢后毒副作用,因而越来越受到人们的关注。口腔黏膜（舌下黏膜和颊黏膜）给药途径具有依从性好、血管丰富和位置相对固定等优点,更重要的是一些脂溶性的药物能经过口腔黏膜细胞间的类脂质成分进入组织和血液发挥药物的作用,为口腔局部应用COX-2抑制剂预防舌癌的发生发展提供有利的解剖及组织学依据。本实验采用选择性COX-2抑制剂塞来昔布膏剂局部应用于SD大鼠舌黏膜,研究对DMBA诱导SD大鼠舌癌发生的抑制作用。首先采用高效液相色谱法检测局部应塞来昔布后大鼠舌黏膜的吸收情况,然后采用光镜法观察组织病理学变化,免疫组织化学染色及Westewrn blot检测COX-2及VEGF-C蛋白的表达,RT-qPCR检测COX-2和VEGF-C mRNA的表达,ELISA检测舌组织中PGE2的含量变化,为局部应用COX-2抑制剂阻断口腔癌发生发展提供实验依据。第一章局部应用COX-2抑制剂塞来昔布在SD大鼠舌组织吸收的研究将35只4周龄清洁级SD大鼠随机分为7组,乙醚麻醉后将6%（w／w）的环氧化酶-2抑制剂塞来昔布膏剂涂抹于SD大鼠左侧舌缘中部黏膜。于给药后的5、10、15、30、60、90、120分钟处死动物,切取舌组织,超声漂洗、匀浆,加入一定体积的乙酸乙酯,旋涡混匀后离心,按一定比例吸取上清液,将上清液置于60℃氮气挥干仪上挥干,流动相溶解残渣,用0.22μm微孔滤膜真空负压过滤后进样。采用高效液相色谱仪检测局部应用塞来昔布膏剂在SD大鼠舌组织的吸收率,比较不同时间点塞来昔布在大鼠舌组织的吸收情况。结果显示：局部应用药物后舌组织内保留时间是4.4分钟,组织中塞来昔布的最低检测限为10μg·L-1 （S/N=3）.舌组织匀浆液中塞来昔布在（25～800）μg·L-1范围内线性关系良好,回归方程为Y-1833.7X+39 255,R2=0.9894 （n=6）;提取回收率为84.75%-90.21%,方法回收率为93.73%～98.85%；日内RSD分别为0.35%、5.21%和3.73%；日间RSD分别为1.44%、4.33%,4.40%,且稳定性良好。局部给药后120分钟内塞来昔布在SD大鼠舌组织中的浓度波动于（0.804±0.056）～（3.382±0.167）μg·g-1之间。在15分钟时药物吸收达最高浓度。实验结果表明,舌组织局部应用塞来昔布后可迅速通过舌黏膜吸收,在舌组织内达到较高的药物浓度。采用高效液相色谱法检测舌组织中的药物浓度及吸收率,具有方法简便灵敏、干扰小、重复性好等优点,为进一步研究口腔局部应用COX-2抑制剂预防口腔癌提供依据。第二章局部应用塞来昔布抑制DMBA诱导的SD大鼠舌癌变作用研究将80只SD大鼠随机分为两组,用1%DMBA丙酮溶液涂抹大鼠左侧舌缘黏膜并联合局部创伤以诱导舌组织癌变,每周3次。塞来昔布组动物局部应用6%（w／w）塞来昔布膏剂涂抹舌黏膜,每周5次。对照组不作此处理。动物分别于第8、12、16、20周处死,每组10只动物。切取舌组织分别进行组织学光镜观察、免疫组织化学染色及Western blot检测COX-2及VEGF-C蛋白表达、RT-qPCR检测COX-2、VEGF-C mRNA的表达以及ELISA测定舌组织中PGE2含量。实验数据处理采用统计软件SPSS 13.0处理,计数资料分别采用R×C卡方检验、Fisher精确概率法、两样本秩和检验和双变量相关分析,计量资料采用One-way ANOVA、析因分析。结果表明,第8周时,组织病理观察两组均未发现癌变,而第12、16、20周对照组SD大鼠舌组织上皮异常增生及癌变的发生率均高于塞来昔布组,两组间差异有统计学意义。免疫组化及Western blot结果显示：第8、12、16、20周时,塞来昔布组COX-2、VEGF-C蛋白表达较对照组显著降低（P<0.05）,两者的表达强度均呈正相关（P=0.000）。RT-qPCR结果显示：塞来昔布对COX-2 mRNA的表达无明显影响,而对VEGF-C mRNA的表达除第8周外,其余各时间点均较对照组明显下调,差异均有统计学意义（P<0.05）。ELISA结果：PGE2标准曲线为：Y=0.273 4Ln （X）+0.185 3,R2=0.994 7。第16、20周时,对照组舌组织中PGE2含量明显高于塞来昔布组,差异有统计学意义（P<0.05）。第8、12周时,两组PGE2含量无明显差异（P>0.05）。通过实验证实,局部应用选择性COX-2抑制剂塞来昔布膏剂具有抑制DMBA诱发的SD大鼠舌组织上皮异常增生及癌变的作用。其作用机制可能与抑制大鼠舌组织COX-2蛋白的活性、抑制PGE2的产生以及抑制VEGF-C的表达等有关,为局部应用选择性COX-2抑制剂预防口腔癌的发生发展提供实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第一章 局部应用COX-2抑制剂塞来昔布在SD大鼠舌组织吸收的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二章 局部应用塞来昔布抑制DMBA诱导的SD大鼠舌癌变作用研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 中英文对照缩略词表
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间研究成果
• 致谢
• 统计学审稿证明