人类心脏发育候选基因hole和DAND5的克隆与功能研究

论文摘要

心脏是脊椎动物器官发生过程中最早形成的结构之一。心脏发育是一个复杂的过程,受一系列基因的精确调控。研究发现,某些基因在时空上的表达紊乱可导致先天性心脏病。目前心血管系统疾病已经成为威胁人类健康最大的两个敌人之一。鉴定在心脏发育过程中起调控作用的基因和分子途径,将促进人们从分子水平认识心脏发育和先天性心脏病发生的机制。MAPK信号传导途径是广泛存在于脊椎动物细胞调控的一种机制,许多转录因子是重要的MAPK靶分子。为了鉴定控制心脏发育和疾病发生的新基因,本研究从心脏cDNA文库中克隆了两个人类新基因Hole和DAND5。Hole基因位于14号染色体,Northern杂交结果表明其仅在心脏、骨骼肌、肝脏、胰腺中有表达,而在心脏的表达最强烈。通过构建增强型绿色荧光蛋白与hole融合基因的真核表达系统,转染COS-7细胞系,瞬时表达后荧光显微镜观察了它编码蛋白的活细胞定位及表达,表明hole蛋白主要在细胞膜和细胞质中表达,而且在细胞质中点缀着大小不一的点状荧光。DAND5基因位于19号染色体,属于DAN家族成员,已发现该家族成员能通过与骨形成蛋白（BMP）结合从而抑制其信号的传导。人类胚胎时期RT-PCR实验证明它在胚胎的各种组织中均有表达。利用GST表达系统,构建pGEX-4T-2-DAND5融合蛋白,通过IPTG诱导得到约48kDa的融合蛋白。构建真核表达载体pCMV-tag2C与DAND5的融合蛋白,转染COS-7细胞系,建立转基因的稳定表达细

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文缩写词简表
• 第一章 引言和文献综述
• 1.1 心脏发育研究简述
• 1.2 心脏发育与转录因子
• 1.2.1 GATA
• 1.2.2 Nkx2.5
• 1.2.3 MEF-2家族
• 1.2.4 bHLH家族
• 1.2.5 BMP家族
• 1.3 MAPK信号途径与心脏发育的关系
• 1.4 本文的研究意义
• 第二章 人类新基因hole的克隆、序列分析及其功能研究
• 2.1 hole基因ORF的克隆和序列分析
• 2.2 hole基因的人类组织Northern杂交结果
• 2.3 hole蛋白的亚细胞定位分析
• 2.4 hole蛋白抑制MAPK信号途径
• 第三章 人类新基因DAND5的克隆及其功能研究
• 3.1 DAND5基因ORF的克隆和序列分析
• 3.2 RT-PCR分析DAND5基因在组织中的表达
• 3.3 DAND5基因在原核细胞中的表达
• 3.4 DAND5蛋白的亚细胞定位
• 3.5 DAND5蛋白抑制MAPK信号途径
• 3.6 DAND5转基因稳定表达细胞系的建立
• 第四章 材料与方法
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 总RNA的抽提
• 4.2.2 人类胚胎心脏PCR cDNA文库的构建
• 4.2.3 巢式PCR（nest PCR）扩增开放阅读框
• 4.2.4 PCR产物的纯化回收
• 4.2.5 PCR产物与T-载体的连接
• 4.2.6 转化（热休克法）
• 4.2.7 质粒的小量制备
• 4.2.8 阳性克隆的筛选与鉴定
• 4.2.9 测序
• 4.2.10 Northern blot
• 4.2.11 反转录 RT-PCR-
• 4.2.12 原核表达重组质粒的制备
• 4.2.13 真核表达重组质粒的构建
• 4.2.14 真核表达重组质粒的大量制备
• 4.2.15 原核细胞的蛋白表达及纯化
• 4.2.16 常规细胞培养及转染
• 4.2.17 亚细胞定位观察
• 4.2.18 基因信号途径的report assay
• 4.2.19 转基因稳定表达细胞系的建立
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1
• 附录2