大肠杆菌系统改造及琥珀酸和5-氨基乙酰丙酸合成途径的构建

论文摘要

进入21世纪,随着环境污染和石油资源的日益枯竭,可持续发展已经深入人心。而工业微生物作为可持续发展的一个重要支撑,是解决资源危机、生态环境危机以及改造传统产业的关键所在。目前,工业微生物技术已经渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域,并扮演着越来越重要角色。而代谢工程已经发展成为一种最有力的优化微生物代谢途径、提高微生物目标产物生产能力的工具。大肠杆菌作为一种研究最透彻的模式微生物具有无可比拟的优越性：遗传背景清晰、易操作、生长迅速、营养要求简单等。因此,通过基因工程改造大肠杆菌发酵生产重要的工业产品,实现工业原材料来源的根本转变具有重要意义。本研究首先在分析了大肠杆菌基因表达调控方式的基础上,构建了一种环境压力诱导型的表达系统。该系统不依赖于人为诱导剂的添加,当菌体进入对数生长期后期,该系统被诱导并转录下游基因。在分析该表达系统的特点后,我们成功将该系统应用于聚羟基丁酸酯（PHB）的发酵生产中。发酵结果显示工程菌株DH5α（pQKZ103）在不添加任何诱导剂的条件下积累菌体干重、PHB浓度以及PHB含量分别为4.1 g/L、3.52 g/L和85.8 wt%；而对照菌株DH5α（pBHR68）在添加0.1mM IPTG诱导后,菌体干重、PHB浓度及PHB含量分别为2.3 g/L,0.98g/L和42.6 wt%。显然,本研究所构建的环境压力诱导型表达系统明显优于IPTG诱导系统。在构建了环境压力诱导型表达系统后,我们具体针对大肠杆菌葡萄糖中心代谢进行了分析。在大肠杆菌发酵葡萄糖生产重组蛋白以及化工原料时,如何解决乙酸分泌问题一直受到大家的关注。大约30%的葡萄糖流向了乙酸的生成,不仅造成了浪费,同时,乙酸的积累对菌体的生长造成了巨大的毒害。在系统分析葡萄糖代谢的基础上,我们采用基因敲除的方法,对大肠杆菌中乙酸相关基因ptsG、poxB、pta以及iclR进行缺失,分析每个基因对乙酸积累的影响。最终构建了乙酸分泌量大大减少的好氧发酵菌株QZ1110平台。同时,我们构建了非编码sRNA的表达载体。在菌株QZ1110中过量表达RyhB sRNA,分析RyhB sRNA对葡萄糖代谢的影响（琥珀酸积累提高7倍）。培养结果初步证实了sRNA作为调节基因表达的工具应用于代谢工程的可行性。随后,我们通过敲除sdhA基因,构建了琥珀酸好氧发酵途径,QZ1111工程菌株积累琥珀酸至26.4 g/L从氧化还原平衡的角度分析,琥珀酸相对于葡萄糖具有更高的氧化还原电势,而PHB相对于葡萄糖具有更低的氧化还原电势。因此,我们将PHB合成途径引入琥珀酸好氧发酵菌株,成功构建了发酵葡萄糖联产琥珀酸和PHB的工程菌株QZ1112。培养结果显示,联产琥珀酸和PHB相比琥珀酸单独发酵具有更大的优势,葡萄糖得到了更好的利用。基于生物炼制的思想,我们构建了同时利用甘油（或葡萄糖）和脂肪酸联产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯（PHA）的工程菌株,这为利用生产生物柴油中产生的副产物提供了一个选择。在构建琥珀酸发酵菌株的基础上,我们将研究集中在与琥珀酸相关的另一种重要的化合物：5-氨基乙酰丙酸（ALA）。过去,该氨基酸主要通过化学合成法合成。近年来,基于C4途径的生物转化法吸引了众多学者的关注和研究,即通过人为添加琥珀酸和甘氨酸继而通过培养的细胞一步催化生成ALA。而本研究则独辟蹊径,意在通过基于大肠杆菌ALA C5合成途径的改造,构建一株、以廉价无机盐为培养基发酵葡萄糖生产ALA的工程菌株。通过培养,我们证实hemA基因是C5合成途径中第一个限速酶,同时我们发现hemL也是C5途径中的关键酶。工程菌株DAL （hemAM, hemL）积累ALA达到2.05 g/L。通过培养我们发现gltX基因的表达不利于ALA的积累,而荧光定量PCR证实gltX基因的表达不利于ALA的积累的原因是由于gltX基因的表达上调了hemB基因的表达。为了加速ALA的细胞外排,降低细胞内ALA的浓度,我们分析了ALA的胞外运输相关蛋白并过量表达rhtA基因,培养结果显示,rhtA的过量表达显著提高了ALA的产量（45.9%）。而通过发酵罐培养,ALA的最大产量为4.13g/L。在大肠杆菌中,hemB基因编码HemB,催化ALA生成胆色素原,因此,可控降解HemB可能有利于ALA的积累。我们通过在基因组上hemB基因的C端添加一段蛋白质降解标签ssrA。在小分子蛋白SspB的协助下,加有ssrA降解标签的HemB蛋白可迅速被ClpXP蛋白酶体降解,从而起到降解HemB的目的。然而意想不到的是,降解HemB蛋白不仅没有提高ALA的产量,反而降低了ALA的产量（25mg/L）,而在敲除sspB基因后,ALA的产量恢复至735 mg/L。这说明降解HemB不利于ALA的积累。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 大肠杆菌环境压力诱导表达系统的构建及应用
• 1.1 引言
• 1.2 实验方案（技术路线与实验内容）
• 1.2.1 实验技术路线
• 1.2.2 实验内容
• 1.2.2.1 环境压力诱导表达系统的构建
• 1.2.2.2 环境压力诱导表达系统的性质分析
• 1.2.2.3 环境压力诱导表达系统在PHB发酵中的应用
• 1.3 实验材料及方法
• 1.3.1 实验材料
• 1.3.1.1 实验相关菌株及质粒
• 1.3.1.2 培养基配方
• 1.3.1.3 分子操作酶及试剂盒
• 1.3.2 实验方法
• 1.3.2.1 gfp及phbCAB基因表达载体的构建
• 2溶液的配制'>1.3.2.2 CaCl₂溶液的配制
• 1.3.2.3 感受态细胞的制备方法
• 1.3.2.4 质粒的化学转化
• 1.3.2.5 质粒的快速检测
• 1.3.2.6 质粒的碱裂解法提取
• 1.3.2.7 琼脂糖电泳
• 1.3.2.8 重组菌株发酵条件
• 1.3.2.9 绿色荧光蛋白的表达分析
• 1.3.2.10 PHB颗粒相差显微观测和荧光显微观测
• 1.3.2.11 电子显微镜样品制备
• 1.3.2.12 PHB检测分析
• 1.4 实验结果
• 1.4.1 环境压力诱导表达系统的构建
• 1.4.2 环境压力诱导表达系统的分析
• 1.4.3 环境压力诱导表达系统在PHB生产中的应用
• 1.4.4 PHB颗粒的观察及分析
• 1.5 本章结论
• 第二章 大肠杆菌乙酸代谢分析以及好氧发酵平台的构建
• 2.1 引言
• 2.2 实验方案（技术路线与实验内容）
• 2.2.1 实验技术路线
• 2.2.2 实验内容
• 2.2.2.1 乙酸代谢相关酶基因的敲除
• 2.2.2.2 相关基因的缺失对乙酸及生物量积累的影响
• 2.2.2.3 相关基因的缺失对PHB积累的影响
• 2.2.2.4 相关基因的缺失对乙酸利用的影响
• 2.3 实验材料及方法
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.1.1 实验相关菌株及质粒
• 2.3.1.2 培养基配方
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.2.1 基因敲除方法
• 2.3.2.2 质粒pSCP及pHBS01的构建
• 2.3.2.3 工程菌株的培养条件
• 2.3.2.4 乙酸利用培养条件
• 2.3.2.5 葡萄糖、乙酸及PHB的检测
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 基因poxB、pta及iclR的敲除
• 2.4.2 低拷贝表达载体pSCP的构建
• 2.4.3 各菌株生长曲线的比较
• 2.4.4 pH非调控下相关基因的缺失对乙酸和生物量积累的影响
• 2.4.5 pH调控下相关基因的缺失对乙酸和生物量积累的影响
• 2.4.6 无机盐培养基中乙酸和生物量积累的比较
• 2.4.7 相关基因的缺失对PHB积累的影响
• 2.4.8 pta敲除对大肠杆菌乙酸利用的影响
• 2.4.9 pH对大肠杆菌乙酸利用的影响
• 2.5 本章结论
• 第三章 小RNA（sRNA）在大肠杆菌代谢工程中的应用
• 3.1 引言
• 3.2 实验方案（技术路线与实验内容）
• 3.2.1 实验技术路线
• 3.2.2 实验内容
• 3.2.2.1 工程菌株QZ1110的培养及代谢产物分析
• 3.2.2.2 RyhB的过量表达对葡萄糖代谢的影响
• 3.3 实验材料及方法
• 3.3.1 实验相关菌株及质粒
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.2.1 sRNA表达质粒的构建
• 3.3.2.2 摇瓶培养条件
• 3.3.2.3 相关代谢产物的检测分析
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 RyhB表达载体的构建
• 3.4.2 乙醛酸途径的激活对葡萄糖代谢的影响
• 3.4.3 过量表达RyhB对葡萄糖代谢的影响
• 3.5 本章结论
• 第四章 琥珀酸发酵以及琥珀酸和聚羟基丁酸酯（PHB）的联产
• 4.1 引言
• 4.2 实验方案（技术路线与实验内容）
• 4.2.1 好氧发酵琥珀酸及PHB实验技术路线
• 4.2.2 实验内容
• 4.2.2.1 琥珀酸脱氢酶基因sdhA的敲除
• 4.2.2.2 工程菌株QZ1111发酵葡萄糖和木糖生产琥珀酸
• 4.2.2.3 ppc基因的过量表达对琥珀酸产量的影响
• 4.2.2.4 琥珀酸和PHB的联产
• 4.3 实验材料及方法
• 4.3.1 实验相关菌株及质粒
• 4.3.2 实验方法
• 4.3.2.1 sdhA基因的敲除
• 4.3.2.2 ppc基因的克隆
• 4.3.2.3 NADH及NADPH浓度测定
• 4.3.2.4 相关代谢产物的检测
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 sdhA基因的敲除
• 4.4.2 ppc基因表达载体的构建
• 4.4.3 工程菌株QZ1111的生长曲线
• 4.4.4 过量表达ppc基因对琥珀酸的影响
• 4.4.5 工程菌株QZ1111补料发酵琥珀酸
• 4.4.6 工程菌株发酵木糖生产琥珀酸
• 4.4.7 分批发酵琥珀酸和PHB
• 4.5 本章结论
• 第五章 生物炼制发酵生产琥珀酸和PHA
• 5.1 引言
• 5.2 实验方案（技术路线与实验内容）
• 5.2.1 实验技术路线
• 5.2.2 实验内容
• 5.2.2.1 sdhA基因的敲除对琥珀酸产量的影响
• 5.2.2.2 pta的敲除对琥珀酸产量的影响
• 5.2.2.3 琥珀酸和PHA的联产
• 5.3 实验材料及方法
• 5.3.1 实验相关菌株、质粒以及引物
• 5.3.2 实验方法
• 5.3.2.1 P1噬菌体转导
• 5.3.2.2 pta基因的敲除
• 5.3.2.3 phaC1基因表达载体的构建
• 5.3.2.4 琥珀酸和PHA发酵条件
• 5.3.2.5 琥珀酸及PHA检测
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 琥珀酸生产菌株的构建
• 5.4.2 发酵甘油积累琥珀酸
• 5.4.3 phaC1表达载体的构建
• 5.4.4 联产琥珀酸和PHA工程菌株的构建
• 5.4.5 补料发酵联产琥珀酸和PHA
• 5.5 本章结论
• 第六章 产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株的构建及优化
• 6.1 引言
• 6.2 实验方案（技术路线与实验内容）
• 6.2.1 实验技术路线
• 6.2.2 实验内容
• 6.2.2.1 大肠杆菌ALA C5相关基因的过量表达对ALA产量的影响
• 6.2.2.2 gltX的表达对C5途径相关基因的调控
• 6.2.2.3 hemA（C5）基因的突变及过量表达对ALA产量的影响
• M的表达量的比较分析'>6.2.2.4 hemA及hemA^M的表达量的比较分析
• 6.2.2.5 相关多基因的共表达对ALA产量的影响
• 2+对ALA产量的影响'>6.2.2.6 Fe²⁺对ALA产量的影响
• 6.2.2.7 rhtA基因的过量表达对ALA产量的影响
• 6.2.2.8 sucA基因的敲除对ALA产量的影响
• 6.2.2.9 udhA基因的过量表达对ALA产量的影响
• 6.2.2.10 hemB的启动子分析
• 6.2.2.11 可控降解HemB及sspB基因的缺失对ALA的影响
• 6.3 实验材料及方法
• 6.3.1 实验相关菌株及质粒
• 6.3.2 培养基
• 6.3.3 实验方法
• 6.3.3.1 ALA C5相关基因表达载体构建
• 6.3.3.2 sucA基因的敲除
• 6.3.3.3 实时定量PCR
• 6.3.3.4 蛋白表达的检测
• 6.3.3.5 ssrA标签的添加及sspB基因的敲除
• 6.3.3.6 ALA发酵条件
• 6.3.3.7 ALA的分析方法
• 6.4 实验结果
• 6.4.1 ALA标准曲线的测定
• 6.4.2 本研究构建质粒图谱
• 6.4.3 基因gltX、hemA和hemL的表达对ALA产量的影响
• 6.4.4 过量表达外源修饰基因hemA对ALA产量的影响
• M和hemL对ALA产量的协同作用'>6.4.5 共表达hemA^M和hemL对ALA产量的协同作用
• 6.4.6 GluRS上调hemB基因的表达
• 6.4.7 过量表达udhA对ALA产量的影响
• 6.4.8 sucA基因的敲除对ALA产量的影响
• 6.4.9 膜蛋白RhtA过量表达加速ALA的胞外运输
• 2+的添加有害于ALA的积累'>6.4.10 Fe²⁺的添加有害于ALA的积累
• 6.4.11 ALA的分批发酵
• 6.4.12 hemB基因启动子的分析
• 6.4.13 HemB蛋白的可控降解有害于ALA的积累
• 6.4.14 sspB基因的缺失恢复ALA的产量
• 6.5 本章结论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 攻读博士学位期间获得奖励与荣誉
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 附录